日本三角涡虫Djβ-actin基因的克隆及再生过程中的表达分析

摘要

涡虫,是属于扁形动物门(Platyhelminthes)涡虫纲(Turbellaria)的动物。淡水涡虫一直被认为是动物界从二胚层辐射对称进化到三胚层两侧对称的典型代表,是首次出现的两侧对称、三胚层的动物。涡虫具有强大的再生能力,其身体的任何部位切割下都可再生出一个完整的个体。真核生物细胞骨架,尤其是肌动蛋白组成的微丝,在细胞运动中发挥非常重要的作用。再生过程是涉及一系列与多种多样的胚胎形态建成现象相关的分化事件,在这些胚胎形态建成过程中细胞骨架起着基础性作用。 本文根据Dugesia ryukyuensis和Dugesia tigrina的beta-actin cDNA序列设计引物,PCR扩增得到日本三角涡虫Djβ-actin基因的部分cDNA序列,然后采用RACE技术获得Djβ-actin基因的全长序列,然后用软件推导出氨基酸序列,并进行系统进化分析。得到全长后设计引物制备探针,进行整体原位杂交,来检测Djβ-actin基因在正常的完整涡虫中以及涡虫再生过程中表达变化。然后利用RNA干扰技术设计引物构建RNA干扰载体,进行Djβ-actin基因的RNAi,进一步分析Djβ-actin基因在再生过程中的作用。 Djβ-actin cDNA全长为1243bp,包括10bp的5'非编码区(5'-UTR),102bp的3'非编码区(3'-UTR)和1131bp的开放阅读框(ORF),其中开放阅读框编码了376个氨基酸的actin蛋白,分子量是41.7KD,在3'-UTR的末端含有加尾信号aataaa以及12bp的poly(A)序列。其功能肽由371个氨基酸组成,为氨基酸序列中第6-376位。氨基酸序列比对分析表明各物种的β-actin的氨基酸序列的相似度都很高,充分说明了β-actin基因在进化过程中高度的保守性。日本三角涡虫与Dugesia ryukyuensis涡虫β-actin的氨基酸序列之间的相似性最高,从进化树中可以看出,日本三角涡虫和Dugesia ryukyuensis涡虫处于同一分支,而与部分哺乳动物、无脊椎动物、鱼类和非洲爪蟾等都处于不同的分支。 原位杂交结果显示,在正常完整的涡虫中Djβ-actin基因在全身各处均有表达。在切割形成的头段、中间段以及尾段,Djβ-actin表达趋近于切割的损伤处,即芽基形成的部位,随再生过程的进行,Djβ-actin表达量逐渐增加,当再生至48h时,Djβ-actin基因在损伤处的表达达到高峰,超过48h后Djβ-actin基因表达逐渐由损伤处分散至全身,当再生至7d时Djβ-actin基因的表达恢复至正常的完整涡虫的水平。由此可以推断Djβ-actin基因参与了涡虫的再生,并发挥了一定的作用。 因无法得知涡虫对于干扰食物的进食量,以及摄取干扰食物后dsRNA的释放以及分布,导致干扰效率不高,所以本实验发现Djβ-actin RNAi后虽表达量稍有减弱,但效果不明显。对涡虫RNA干扰的机制和方法还有待改进,在今后的实验中将会继续进行RNA干扰的研究。

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第一章 综 述

1 涡虫概述

2 涡虫的采集饲养及疾病防治

3 细胞骨架及肌动蛋白概述

4 选题依据及研究意义

第二章 日本三角涡虫Djβ-actin cDNA序列的克隆与序列分析

1 前言

2 实验材料

5 讨论

第三章 日本三角涡虫Djβ-actin在再生过程中及RNAi后的表达分析

1 前言

2 实验材料

3 溶液的配制

4 实验方法

5 实验结果

6 讨 论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章