大豆BCCP基因家族、花生CHI基因家族表达及进化分析

摘要

基因家族对于植物进化有重要的意义,多个基因拷贝能带来更多的变异机会和更小的纯化选择。基因家族的出现,会通过影响蛋白质编码基因的表达水平,进而在整体上影响组织器官的功能和植株的性状。植物中基因家族各成员对于蛋白质翻译的贡献是怎样的?其时空表达特异性是怎样的?是否只与启动子调控有关?本论文以大豆生物素羧基载体蛋白(Biotin carboxyl carrier protein, BCCP)基因家族和花生查尔酮异构酶(Chalcone-flavanone isomerase, CHI)基因家族为对象,从转录水平、启动子功能和进化等方面阐述了大豆BCCP和花生CHI家族基因的数量、分布、表达和遗传进化。
　　BCCP是乙酰辅酶A羧化酶的一个亚基,后者是脂肪酸合成的关键限速酶,本研究的目的之一是分析研究BCCP基因家族在种子发育时期的表达模式。通过对大豆基因组数据库的查询,获得了7条大豆BCCP基因的启动子序列,经初步分析后设计引物克隆了这些基因的启动子片段(1000~2000bp),与报告基因GUS连接构建表达载体,通过农杆菌介导侵染烟草叶圆盘,获得转基因植株,通过组织染色分析启动子在烟草各组织内的转录活性。结果表明,启动子p19g03530在转基因植株中表现出较强的组成型转录活性,在种子各发育时期和植株各发育时期观察到了GUS基因的表达;启动子p18g02670在在种子各发育时期和植株各发育时期观察到了GUS基因的表达;启动子p18g47850能启动GUS在种子胚胎发育后期表达,但表达量始终不高。启动子p13g44040能启动GUS在种子鱼雷胚时期子叶部位表达,但表达量不高。对已获得成株的株系叶片进行GUS染色,结果表明各启动子均在叶片中有启动转录的活性,但启动转录的强度有较大差别。启动子p13g44040在转基因种子发育时期检测到了较低的转录活性,在转基因烟草的叶脉中也检测到了其活性。目前对于其他大豆BCCP启动子的的转基因株系的检测正在进行。
　　本实验还通过实时荧光定量的方法对BCCP家族成员在大豆各主要组织内的转录水平进行了测定,结果表明BCCP19g03530基因在种子发育时期的表达量较高,结合启动子的研究,初步确认了在大豆BCCP家族各个成员在种子内的表达模式。
　　CHI是苯丙氨酸代谢途径中一个重要的酶,最终代谢产物为黄酮类化合物,它涉及的植物生理功能具有多样性,如色素形成,信息素合成,抗病原微生物反应,豆科植物结瘤等。本实验通过筛选花生转录组数据库和5’末端扩增,分别克隆花生CHI基因的cDNA和基因组DNA的全长序列,其cDNA序列长度为758bp包括675bp的ORF区,可编码含224个氨基酸的肽链;花生CHIⅡ完整的基因结构包括4个外显子,三个内含子,碱基序列长度为1620bp。通过染色体步移克隆了CHIⅠ和CHIⅡ的部分启动子调控区序列,并对上面的顺式作用元件进行了统计分析,结果表明CHIⅡ启动子具有根特异表达启动子的特点。通过对不同颜色花生品种和花生不同组织的实时荧光定量分析表明,CHIⅡ与植株颜色没有关系,其主要转录部位在根中。
　　使用NCBI和Phytozome等数据库下载了17条与花生CHI同源的基因序列,对这些序列进行了适应性进化分析表明,CHI基因整体上受纯化选择,部分碱基位点的进化是中性的。
　　本研究首次从花生中克隆了CHIⅡ型基因,通过多种研究方法对大豆BCCP和花生CHI基因家族进行了多角度的研究,对这两个基因家族的调控方式有了初步认识,并对CHI基因家族的进化进行了探讨。该研究为进一步揭示大豆BCCP和花生CHI家族基因各个成员的功能奠定了基础。

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第一部分 文献综述

1.1基因家族的进化及功能意义

1.2本实验中研究的基因家族介绍

1.3基因家族表达调控机制的研究方法

1.3.1.启动子及研究方法

1.3.2.表观遗传学对基因家族表达的影响

1.3.3 mRNA水平的研究方法

1.4本研究的目的与意义

第二部分 实验材料和方法

2.1 材料和试剂

2.1.1植物材料

2.1.2菌种与载体

2.1.3 化学试剂及培养基

2.1.4 培养基配方

2.2 仪器与设备

2.3 实验方法

2.3.1 大肠杆菌 DH5α 感受态的制备

2.3.2农杆菌感受态的制备

2.3.3农杆菌的转化

2.3.4 DNA 胶回收

2.3.5 CTAB法提取DNA

2.3.6 CTAB 法提取植物 RNA

2.3.7 DNase I纯化总 RNA

2.3.8反转录 PCR

2.3.9 引物设计和PCR

2.3.10 PCR扩增产物酶切

2.3.11连接反应

2.3.12阳性载体的筛选

2.3.13烟草无菌苗的培养

2.3.14叶盘法转化烟草

2.3.15 GUS组织化学染色

2.3.16 qRT-PCR

2.3.17花生CHI家族基因的实时荧光定量PCR分析

2.3.18花生CHI家族基因启动子调控区的克隆

2.3.19适应性进化分析

第三部分 实验结果与分析

3.1大豆BCCP家族成员启动子研究的实验结果与讨论

3.1.1 数据库搜索

3.1.2 启动子片段的克隆

3.1.3 启动子调控区的生物信息学分析

3.1.4 启动子GUS表达载体的构建

3.1.5 农杆菌介导的烟草转化及PCR鉴定

3.1.6 转基因烟草的GUS组织染色

3.1.7 BCCP 基因家族不同成员的表达分析

3.1.8 小结和讨论

3.2花生查尔酮异构酶家族基因的克隆、表达和进化分析

3.2.1 CHI的生物信息学分析

3.2.2 花生CHIⅡ基因全长的克隆

3.2.3 花生CHI家族基因启动子克隆与分析

3.2.4 花生CHI家族基因的表达模式分析

3.2.5 花生CHI家族基因适应性进化分析

3.2.6 花生CHIⅠ与CHIⅡ基因扩张模式的分析

3.2.7 CHIⅠ和CHIⅡ基因发生分歧的时间估算

3.2.8 小结和讨论

参考文献

硕士期间发表的文章

致谢