基于基因组分析的地衣放线菌的次生代谢产物研究

摘要

地衣是由真菌与蓝藻（或绿藻）形成的稳定的共生有机体。地衣的分布范围十分广泛，可在多种极端环境中生存，并且凭借其产生的具有多种活性的代谢产物在生态环境中起着重要作用。除了共生真菌和共生藻以外，地衣共生体中还存在着大量的细菌，它们为地衣共生系统中的真菌和藻类提供氮源、磷源、生长激素类物质，并协助光合作用和抵御生物胁迫等等。地衣细菌中包含大量的放线菌，它们起着生态防护作用。但是目前对地衣放线菌的物种多样性、特殊的生物活性以及在地衣共生系统中的地位和作用等研究甚少。因此，实验室开展了地衣稀有放线菌代谢产物的研究，以期阐明地衣放线菌在地衣共生系统中的生物学地位。 本实验以分离自网脊肺衣中的放线菌目微杆菌科Subtercola属的稀有放线菌菌株9846a为研究对象，对其进行了全基因组测序。根据全基因组鸟枪法策略，利用Illumina MiSeq平台第二代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）对菌株9846a进行全基因组双末端测序，下机数据表明，菌株9846a的Reads总数为5,825,924，碱基总数为172,494,754bp，碱基识别准确率在99%以上的碱基占碱基总数的81.63%，GC含量为67.4%。下机数据经过筛选、质量评估、过滤低质量数据后被重新组装，进行基因预测及功能注释，结果表明菌株9846a中同时存在抗生素抗性基因与抗生素合成基因，还存在CRISPRs回文序列，具有噬菌体触发性免疫功能。在功能注释中发现菌株9846a全基因组中有4,125个蛋白编码序列，并且其基因产物主要集中在生物合成过程方面，如碳水化合物和氨基酸的运输及代谢。在antiSMASH平台上对菌株9846a可产生的次生代谢产物进行预测，经同源基因簇的比对可知，菌株9846a可能产生的主要次生代谢产物为天然类胡萝卜素、脂肪酸以及烷基间苯二酚等。 在全基因组分析与产物预测的基础上，对菌株9846a使用ISP2液体培养基进行摇床发酵培养，50L发酵液经萃取旋蒸得粗提产物浸膏5.9g。利用双层平板法对发酵产物进行抑菌活性分析，发现其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等有较为理想的抑制效果。利用硅胶柱层析、凝胶柱层析、高效液相制备以及逆流色谱制备等手段，将产物分离纯化得到十二个组分。经核磁共振谱（NMR）、质谱（MS）检测图谱比对，联合相关文献，推断出化合物的分子式和结构式，鉴定得到6个长链脂肪烃，分别为2,19-二甲基二十一烷、十五烷、2,16-二甲基十七烷、(E)-2,12-二甲基十四烷基-7-烯、3-甲基十五烷、2,15-二甲基十七烷。长链脂肪烃能够抵抗外界的不利环境，维持地衣系统内部环境的稳定性，特别是当地衣系统受到高盐、低温、低氧等外部环境胁迫时。 本实验对地衣稀有放线菌菌株9846a进行了全基因组测序以及基因分析，并进一步对其次生代谢产物进行了分离鉴定以及活性分析，为地衣细菌中天然产物的开发利用提供了可参考的方法，为进一步阐明地衣细菌在地衣共生系统中的地位和作用提供了依据，对地衣细菌的研究具有积极意义。

目录

缩略词说明

第一章 前言

1.1 地衣细菌及其次生代谢产物研究概况

1.2 稀有放线菌及其次生代谢产物研究进展

1.3 细菌全基因组测序技术

1.4 次生代谢产物预测

1.5 次生代谢产物的提取、分离与鉴定

1.6 本课题的研究目的及意义

第二章 地衣放线菌菌株9846a全基因组测序分析

2.1 菌株活化和鉴定

2.1.1 材料和方法

2.1.2 结果与分析

2.2 菌株9846a全基因组测序、组装评估及功能注释

2.2.1 材料和方法

2.2.2结果与分析

2.3 菌株9846a基因组功能预测分析

2.3.1 实验方法

2.3.2 结果与分析

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 地衣放线菌菌株9846a次生代谢产物分析

3.1 材料和方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 发酵液的制备

3.2.2 生物活性分析

3.2.3 次生代谢产物分析

3.3 讨论

3.4 本章小结

第四章 全文总结

参考文献

附录

致谢