果树GA生物合成基因-贝壳杉烯氧化酶和20-氧化酶的克隆及表达模式的初步研究

摘要

该文克隆了赤霉素生物合成途径中关键合成酶：贝壳杉烯氧化酶和20-氧化酶,并研究了二者在果树生长发育中的表达规律.主要结论如下：1.利用保守区域的兼并引物克隆了平邑甜茶,丰香草莓和碧桃贝壳杉烯氧化酶基因的长为410bp的中间片段,以中间片段序列为线索又克隆到草莓贝壳杉烯氧化酶的全长,和碧桃此酶的3’端.2.在丰香草莓的不同发育部位克隆到同源性为88.2﹪的两个贝壳杉烯氧化酶的基因片段.3.对一级结构分析发现4段非常保守的区域,推测是在此酶行使功能时的重要组成部分.4.利用半定量RT-PCR的方法结合地高辛标记法,贝壳杉烯氧化酶在果树中的表达是受发育调控的,其在旺盛生长的组织中表达量高,在植株旺长期的成年叶中表达量也很高.5.20-氧化酶负责将生物活性低的GAs转化成生物活性高的GAs.该文采用RT-PCR的方法放大表达信号,发现可以在发育中的叶片和茎中检测的到.6.20-氧化酶在苹果成年叶中表达量很低.7.Southern杂交证明贝壳杉烯氧化酶是多拷贝的.

目录

英文缩略表

1前言

1.1 GA的生物合成途径及部位

1.1.1 GA的生物合成位置

1.1.2 GA的生物合成途径

1.2传导受阻引起的矮化

1.3 GA对花、果、种子发育的作用

1.4 GA与外界环境的关系

1.4.1 GA与光的关系

1.4.2 GA与温度的关系

1.5 GA促进细胞伸长的作用机理

1.6小结

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株与质粒

2.1.3酶及生化试剂

2.2试验方法

2.2.1总RNA的提取

2.2.2反转录体系及程序

2.2.3目的基因片段的获得

2.2.4 3’末端的获得

2.3.5'RACE克隆方法

2.3.15'RACE所用引物

2.3.2反转录和加尾反应

2.3.3 5'RACE PCR体系及程序

2.3.4片断的回收

2.4全长cDNA的获得

2.5 GA-20氧化酶的克隆

2.5.1 20-氧化酶特异引物的合成

2.5.2微量法提取平邑甜茶总DNA

2.5.3 20氧化酶的PCR体系及程序

2.6序列分析

2.6.1同源性分析

2.6.2二级结构及跨膜结构分析

2.7 Southern杂交

2.7.1基因组DNA的提取

2.7.2用于Southern杂交的DNA大量酶切

2.7.3用碱性缓冲液在尼龙膜上进行Southern转膜

2.8地高辛DNA标记及免疫学检测

2.8.1地高辛标记探针

2.8.2杂交

2.8.3免疫学检测

2.8.4染色反应

2.9半定量PCR法检测ent-kaurene oxidase酶的表达方式

2.9.1内参18S rRNA引物的合成

2.9.2步骤

2.10 20-氧化酶的RT-PCR检测

3结果与分析

3.1目的基因cDNA片段的分离

3.1.1中间片段的分离

3.1.2 3’端的克隆

3.1.3 5’端的克隆

3.1.4全长基因的克隆

3.2贝壳杉烯氧化酶的同源性分析

3.2.1氨基酸序列的比较

3.2.2同源性分析

3.3草莓全长基因的二级结构分析

3.4 20氧化酶的克隆

3.5半定量RT-PCR

3.5.1持家基因18SrRNA的定量分析

3.5.2半定量RT-PCR模板起始量的确定

3.5.3半定量RT-PCR检测苹果贝壳杉烯氧化酶的表达

3.5.4半定量RT-PCR检测草莓和碧桃的贝壳杉烯氧化酶的表达

3.6 20-氧化酶的RT-PCR检测

3.7贝壳杉烯氧化酶基因拷贝数的确定

4讨论

4.1关于RACE实验方法

4.1.1实验设计方面

4.1.2药品的选择

4.2关于地高辛标记和检测体系

4.3半定量PCR的可靠性

4.4 3’非编码区对基因的调控

4.5贝壳杉烯氧化酶是新类型的P450酶

4.6贝壳杉烯氧化酶是一个多基因家族

4.7果树特有的赤霉素合成方式

5结论

参考文献

致谢