菊花再生体系的建立及农杆菌介导绿色荧光蛋白（GFP）基因转化的研究

摘要

该研究以菊花(Dendranthema morifolium)品种'日本黄'、'阳光'、'国华积富'为试验材料,研究了不同品种、不同激素浓度配比对菊花愈伤组织、不定芽和根诱导的影响.优化了菊花再生条件,获得了菊花叶片高效再生体系.试验结果表明,品种'日本黄'的再生能力明显高于其他两个品种,并筛选出诱导愈伤组织、不定芽和根的最佳培养基.研究中同时也发现,品种'日本黄'叶片接种在MS+NAA(1mg/L)+6-BA(3mg/L)培养基上,经过一段时间的培养,可直接再生出不定芽,并且芽诱导率高达100％,繁殖系数达8.54,再生芽在1/2MS+NAA(0.2mg/L)+IBA(0.2mg/L)培养基上经过10天左右可诱导出根,生根率可达100％,完全可以满足遗传转化的需要.在建立了菊花品种'日本黄'再生体系的基础上,利用农杆菌介导的遗传转化法进行遗传转化研究.试验结果表明,叶盘预培养、农杆菌菌液OD600值、侵染时间和共培养时间均对菊花的遗传转化率有较大影响.同时得出不经过预培养、OD<,600>=0.6、侵染10分钟和共培养4天菊花遗传转化率最高,同时考虑了滤纸帽法对转化率的影响.共培养后把叶盘转入MS+NAA(1mg/L)+6-BA(3mg/L)+Kana(30mg/L)培养基上进行分化筛选培养.30天后可分化出不定芽,把不定芽转到MS+NAA(1mg/L)+6-BA(3mg/L)+Kana(50mg/L)培养基上进行抗性芽的筛选,转到1/2MS+NAA(0.2mg/L)+IBA(0.2mg/L)+Kana(25mg/L)培养基上进行生根筛选.把经抗性筛选得到的转基因苗通过PCR扩增表明,转基因植株中可以检测出有目的基因GFP基因的存在,目的基因己成功插入到菊花的基因组中.

目录

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符号说明

摘要

1引言

2研究进展

2.1菊花育种研究现状

2.1.1菊花的种质资源

2.1.2菊花传统育种及品种改良

2.1.3菊花基因工程育种

2.2 GFP研究进展

2.2.1 GFP的基本特征

2.2.2 GFP在分子生物学研究中的应用

2.3农杆菌的研究进展

2.3.1农杆菌转化植物的步骤

2.3.2转化方法

3材料和方法

3.1试验材料

3.1.1品种

3.1.2农杆菌菌种

3.1.3质粒

3.1.4培养基

3.1.5试剂

3.1.6 PCR引物

3.1.7常用溶液

3.1.8常用仪器

3.2试验方法

3.2.1 再生体系的建立

3.2.2 转基因植株的获得

3.2.3 转基因植株的鉴定

4结果与分析

4.1再生体系的建立

4.1.1 愈伤组织的诱导

4.1.2 芽的诱导

4.1.3 直接诱导芽再生培养基的筛选

4.1.4 生根和向温室移栽

4.2转基因植株的获得

4.2.1 农杆菌动态生长曲线的绘制

4.2.2 选择压力的确定

4.2.3 叶盘的预培养

4.2.4 农杆菌侵染叶盘

4.2.5 转基因植株的鉴定

5讨论

6结论

参考文献

致谢

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