小麦细胞壁蛋白expansin基因的分离及其功能分析

摘要

小麦是世界性的重要粮食作物，在我国是仅次于水稻的第二大粮食作物，其生长和产量直接关系到人类食物的供应。但是，小麦抗旱分子机制研究相对滞后。研究小麦生长发育调控对于提高小麦产量具有重要意义。植物细胞的生长与细胞壁的扩张有关，对细胞壁扩张机制进行研究对于调控植物生长至关重要。近年来发现，膨胀素蛋白在细胞壁扩张过程中起着重要作用。本研究从小麦胚芽鞘中获得了膨胀素基因全长，命名为Tri-EXPB1(Triticumaesitivumβ-EXPANS1N1)。构建了真核表达载体，通过农杆菌介导法转化烟草，获得了转基因植株；构建了原核表达载体，在大肠杆菌中表达Tri-EXPB1膨胀素蛋白，免疫家兔制备了抗体；以小麦胚芽鞘为材料，通过PCR、RT-PCR技术，研究了Tri-EXPB1的表达特性以及对干旱胁迫的反应；以转基因烟草为材料，初步研究了Tri-EXPB1基因的生物学功能。主要结果如下： 根据已知的膨胀素序列设计兼并引物，利用RT-PCR技术和3’-、5'-RACE技术，从小麦胚芽鞘中分离了Tri-EXPB1基因全长cDNA，命名为Tri-EXPB1，序列比较发现Tri-EXPB1与GenBank中注册的β-膨胀素基因具有高度的同源性；氨基酸序列分析发现，推断的Tri-EXPB1蛋白氨基酸序列中含有β-膨胀素家族蛋白的所有特征，属于β-膨胀素基因家族中的一员。 为了研究膨胀素基因Tri-EXPB1的功能，构建了pBI121XB1S表达载体。通过农杆菌介导的方法转化烟草，获得了转基因植株。 取小麦萌发期的胚芽鞘、根系和真叶等提取RNA，通过RT-PCR方法检测了Tri-EXPB1基因的转录表达特性，结果发现：Tri-EXPB1基因在小麦根、真叶和胚芽鞘中均有表达，在胚芽鞘中表达水平高，在根中和真叶中表达水平较低。在小麦萌发期的不同时间取胚芽鞘提取RNA，RT-PCR法检测胚芽鞘不同生长时间Tri-EXPB1基因的表达，结果发现Tri-EXPB1mRNA表达量与小麦胚芽鞘生长过程关系紧密，基因的表达周期与胚芽鞘的生长周期相吻合。由于小麦胚芽鞘的生长主要是细胞伸长生长的结果，没有细胞分裂过程，推测Tri-EXPB1基因在调控细胞伸长生长过程中起着重要作用。 对萌发期小麦幼苗进行水分胁迫处理，取根、真叶和胚芽鞘检测Tri-EXPB1mRNA表达量，结果发现水分胁迫诱导了Tri-EXPB1mRNA表达。在小麦胚芽鞘伸长生长的不同时间取样检测Tri-EXPB1mRNA表达，同时检测水分胁迫对胚芽鞘的生长抑制，结果同样发现，水分胁迫诱导了胚芽鞘中Tri-EXPB1mRNA表达，且表达周期与胚芽鞘的生长周期相一致。因此，推测水分胁迫诱导Tri-EXPB1基因表达是小麦胚芽鞘对水分胁迫的一种适应方式。 对转基因烟草的研究观察发现，过表达Tri-EXPB1基因明显影响了烟草的生长发育过程。促进了烟草生育前期的营养生长，导致烟草开花期提前，缩短了烟草的生命周期，促进了早熟；诱导了地上部分枝和地下侧根的形成。这些结果表明，来源于小麦胚芽鞘的β-膨胀素基因Tri-EXPB1明显影响了双子叶植物烟草的生长和发育。过去一般认为，β-膨胀素在单子叶植物中居多，与单子叶植物的生长发育关系密切，对双子叶植物生长发育影响较小。本研究的发现与前人的观点不太一致。 对转β-膨胀素Tri-EXPB1基因烟草的抗旱性进行了初步研究，发现干旱胁迫条件下，转基因烟草萌发率高，苗期生长大大快于野生型，说明转基因烟草的抗旱性增强。 构建了原核表达载体，利用大肠杆菌特异性地表达Tri-EXPB1蛋白，免疫家兔，制备了抗体，效价检测证明抗体制备成功且效价较高。

目录

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摘 要

1.前言

2.材料与方法

3结果与分析

4讨论

5主要结论

参考文献

附录

致 谢