丝状真菌遗传转化系统的建立

摘要

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schl)可侵染多种植物，分布广泛，是很多植物维管束病害的病原真菌，常引起枯萎病，是重要的真菌类群，开展其功能基因的研究，对于了解镰刀菌与其寄主之间互作的分子机理，具有重要的理论和实际意义。而通过DNA插入突变产生突变体是研究基因功能的重要手段。 疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus Tsiklinsky)是一种广泛分布的嗜热真菌，是真核生物中生长上限温度很高的一种真菌，从该菌中已分离了多种嗜热酶，如热稳定的蛋白酶、糖化酶、木聚糖酶、几丁质酶及α-半乳糖甘酶等，克隆了糖化酶，几丁质酶的基因，并进行了真核表达，使得该菌种在工、农业生产和微生物研究中的作用越来越大。目前，对该嗜热菌感受和传导信号的机制尚不清楚。通过遗传转化，向菌株基因组随机插入外源质粒DNA，构建该菌的突变体，对探索该菌的嗜热性机制具有重要意义。 原生质体是研究和建立真菌遗传转化系统的重要工具，为了建立限制性内切酶介导的遗传转化系统，考察了原生质体形成和再生的各种因素的影响。以尖孢镰刀菌和疏绵状嗜热丝孢菌为供试菌株，研究了菌龄、酶的种类及浓度、酶解时间、酶解温度和稳渗剂对原生质体制备的影响及稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明，制备尖孢镰刀菌原生质体比较适宜的条件为：PDB液体培养基培养18h，以0.7mol/LNaCl为稳渗剂，10mg/mL的溶壁酶，30℃酶解4h，原生质体再生以0.7mol/L蔗糖作稳渗剂为最佳。制备嗜热丝孢菌原生质体比较适宜的条件为：PDB液体培养基培养28h，以0.7mol/LNaCl为稳渗剂，15mg/mL的溶壁酶，30℃酶解4h，原生质体再生以0.7mol/L蔗糖作稳渗剂为最佳。 利用限制性内切酶介导的整合技术成功的转化尖孢镰刀菌，以研究其致病的分子机制。以含有潮霉素磷酸转移酶基因的质粒pUCATPH转化原生质体，共获得转化子200多个，转接5代能稳定遗传。PCR验证潮霉素基因己插入转化子基因组中。通过表型观察，发现20株生长异常的转化子。而转化嗜热丝孢菌却没有得到转化子。在植物转化载体pROK2基础上导入带有真菌启动子的潮霉素B抗性基因片段PtrpC-hph-TtrpC，构建了一个农杆菌介导的转化载体pROK2-PtrpC-hph-TtrpC，进行了酶切和PCR鉴定，并转化农杆菌LBA4404。由于其含有带真菌启动子的标记基因hph，故可用于真菌转化。利用这一转化系统，成功地实现了尖孢镰刀菌的遗传转化。通过对转化子的PCR检测分析表明，潮霉素抗性基因已整合进尖孢镰刀菌基因组中，部分转化子表现为生长和形态异常。而转化嗜热丝孢菌却没有得到转化子。 对农杆菌介导转化尖孢镰刀菌获得T-DNA插入突变体的体系进行了优化，在尖孢镰刀菌孢子浓度10<'6>个/mL，农杆菌OD<,600>=0.25，AS浓度为300μmol/L的条件下共培养48小时转化率最高，可达6～15个/10<'6>个孢子。共获得转化子400多个，连续转接5代能够稳定遗传。PCR验证潮霉素抗性基因已整合进转化子基因组DNA中，部分转化子表现为生长和形态异常。该转化体系的建立为研究该菌的致病机制和功能基因奠定了基础。 本研究分别采用两种常用的遗传转化方法分别对尖孢镰刀菌和嗜热丝孢菌进行了转化，尖孢镰刀菌两种方法均获得了成功，并获得了表型突变体，而嗜热丝孢菌却都没有成功，本文对此从标记基因，农杆菌菌株，载体，标记基因的启动子等方面进行了分析。

目录

声明

第一章文献综述

第二章限制性内切酶介导的丝状真菌的遗传转化

第一节尖孢镰刀菌和嗜热丝孢菌原生质体的制备与再生

1.材料与方法

2.结果

第二节REMI转化

1.材料与方法

2.结果

第三节讨论与分析

1.原生质体的制备与再生

2.REMI转化

第三章根癌农杆菌介导的丝状真菌的遗传转化及T-DNA插入突变体的获得

1.材料和方法

1.1材料

1.2载体的构建

1.3抑制农杆菌生长的抗生素最佳浓度筛选

1.4农杆菌的转化和培养

1.5转化条件变化对转化效率的影响

1.6转化子的PCR分析

1.7转化子的稳定性测定

1.8表型突变体的鉴定

2.结果与分析

2.1载体pROK2-PtrpC-hph-TtrpC的构建

2.2转化结果

2.3转化子的PCR验证

2.4稳定性检验

2.5表型观察

3.讨论

3.1农杆菌菌株的选择

3.2共培养时间

3.3共培养温度

3.4 AS的浓度

3.5农杆菌和受体菌的比例

第四章结论与建议

1.结论

2.建议

参考文献

致谢

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