有机磷农药残留高效降解微生物的筛选、鉴定及降解机理研究

摘要

有机磷农药毒死蜱是目前全世界生产和销售量最大的杀虫剂之一，由此带来的环境污染问题也受到人们的普遍关注。国内外对毒死蜱的微生物降解进行了较为广泛的研究，对于其主要降解途径有了初步的了解，但尚未有将毒死蜱完全降解或矿化的高效降解菌的研究报道。 本研究应用微生物富集驯化方法，筛选分离到多株毒死蜱彻底降解细菌和真菌，对其降解特性和降解机理进行研究；并对毒死蜱降解菌的混合培养及其降解酶的降解特性进行了探讨。主要研究内容加下： 1．从三个农药厂的污水处理池活性污泥中筛选获得多株能高效降解毒死蜱的细菌DM、TRP、TCR和真菌TCF，通过形态学、生理生化和16S/18S rDNA序列同源性分析，将其分别鉴定为副球菌属(Paracoccus sp．DM/TRP)、沙雷菌属(Serratia sp．TCR．)和丝孢酵母属(Trichosporon sp．TCF)；其16S/18S rDNA基因序列在GenBank中的注册号分别EF070123、EF070124、EF070125和EF091819。 2．在纯培养条件下，运用紫外可见分光光度法(UV-Vis)、气相色谱法(GC-FPD)和高效液相色谱(HPLC)法，分别测定了各菌株对毒死蜱及其降解中间产物三氯吡啶酚的降解性能。在pH 7和30℃条件下，细菌DM和TRP都能同时将50mg/L的毒死蜱和三氯吡啶酚在5天内完全降解；细菌RCR只能将毒死蜱转化为三氯吡啶酚；真菌TCF能将50mg/L的三氯吡啶酚在4天内完全矿化，也能将50mg/L的毒死蜱在7天内降解。测定了不同接种量、外加碳源、温度、pH及毒死蜱浓度对菌株降解能力和菌体生长的影响。结果表明：以毒死蜱为唯一碳源、接种量0.15～0.3g/L、温度15～35℃、pH 7～9、毒死蜱浓度25～200mg/L时，各菌株的降解效果较好；外加碳源会显著增强微生物对毒死蜱的降解。 3．沙雷菌(Serratia sp．)TCR．和丝孢酵母(Trichosporon sp．)TCF共培养后，能显著增强其对毒死蜱的降解能力，50mg/L，的毒死蜱在18小时内即可被完全矿化；再与副球菌(Paracoccus sp．)TRP混合培养后，12小时可完全降解50mg/L的毒死蜱。在含50mg/L毒死蜱的液体培养条件下，混合培养菌的最适降解条件为：接种量0.15g/L、温度30℃、pH 8、外加碳源(蔗糖)0.5％。 4．对毒死蜱降解的微生物代谢途径，通过气相色谱一质谱联用(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)和薄层色谱(TLC)分析表明，三氯吡啶酚是最主要的降解中间产物。细菌DM、TRP和真菌TCF都能以三氯吡啶酚或吡啶为唯一碳源或氮源生长，表明降解过程中伴随着吡啶环的断裂，最终彻底矿化成二氧化碳和水。各菌株还可降解三氯吡啶酚、吡啶、甲基对硫磷、克百威等，具有较为广泛的底物谱，显示出其在被污染环境修复中的应用潜力。 5．运用SDS．PAGE和Native-PAGE对诱导和非诱导条件下菌体的全细胞蛋白质电泳分析表明，毒死蜱降解酶在副球菌DM、TRP中可能为诱导型表达，而在沙雷菌TCR和丝孢酵母TCF中可能为组成型表达。各菌株粗酶活性分析表明，粗酶液能将50mg/L的毒死蜱快速降解为无毒物质；降解酶在pH 7～9和20～40℃活性较高，最适pH8，降解酶最适温度细菌TRP为30℃、真菌TCF在35℃：此粗酶液可用于果蔬表面农药残留的快速解毒和清除。

目录

声明

摘要

英文缩略词

1前言

1.1有机磷农药残留的微生物降解概述

1.1.1有机磷农药的结构和毒性

1.1.2有机磷降解菌及代谢方式

1.1.3有机磷降解酶及作用特点

1.1.4有机磷降解基因及遗传特性

1.1.5应用前景及展望

1.2毒死蜱的微生物降解研究现状

1.2.1毒死蜱的理化性质和环境行为

1.2.2毒死蜱降解菌及代谢途径

1.2.3存在的问题

1.3本研究的内容、目的及意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1药品试剂

2.1.2仪器设备

2.1.3培养基

2.1.4试剂配制

2.2实验方法

2.2.1降解菌的富集驯化与筛选分离

2.2.2降解菌的菌种鉴定及系统发育分析

2.2.3降解菌的生长特性和降解性能

2.2.4降解中间产物的检测及降解菌的底物谱

2.2.5毒死蜱降解基因的定位与克隆

2.2.6毒死蜱降解酶的特性研究

3结果与分析

3.1毒死蜱降解菌的分离与鉴定

3.1.1菌株的形态学观察

3.1.2菌株的生理生化特性

3.1.3菌株的16S/18S rDNA系统发育分析

3.1.4毒死蜱降解菌的系统发育进化分析

3.2菌株的生长特性及降解性能研究

3.2.1菌体生长和农药残留量的测定

3.2.2菌株纯培养降解性能分析

3.2.3共培养和混合培养菌的降解性能

3.3降解中间产物的检测及降解菌的底物谱

3.3.1毒死蜱降解中间产物的检测

3.3.2毒死蜱降解菌的底物谱

3.4毒死蜱降解基因的定位与克隆

3.4.1毒死蜱降解基因的定位

3.4.2 mpd基因的克隆

3.5毒死蜱降解酶的特性研究

3.5.1降解酶的表达特性

3.5.2粗酶液的降解性能

3.5.3温度和pH对酶促降解的影响

4讨论

4.1毒死蜱的降解微生物

4.2毒死蜱的微生物降解途径

4.3毒死蜱降解基因的克隆

4.4毒死蜱降解酶的分离纯化

4.5下一步工作设想

5结论

参考文献

致谢

攻读学位期间完成论文