抗除草剂和多价抗虫基因导入水稻光温敏核不育系的研究

摘要

杂草和害虫的危害是导致水稻减产的重要原因，每年由此给全球水稻生产造成的损失高达数百亿美元。为了提高杂交水稻的抗虫性、方便直播制种和除草，避免人们对抗生素筛选标记的安全性顾虑，我们开展了抗除草剂、抗虫植物表达载体的构建和水稻光温敏核不育系的转化研究。抗除草剂、抗虫光温敏核不育系水稻培育成功，将有望在抗除草剂和抗虫杂交水稻培育、杂交水稻直播栽培和草害防治、杂交稻机械化制种中发挥重要作用。 本文构建了包含抗除草剂基因Epsps和3个抗虫基因(马铃薯蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ、苏云金杆菌毒蛋白基因Bt cryl(A)及雪花莲外源凝集素基因(GNA)的植物表达载体。其中，除草剂基因Epsps不仅在实验中作为筛选标记基因方便进行筛选，而且可以使作物获得除草剂抗性而方便除草、直播和机械化制种。 基因枪法和农杆菌介导转化法将连锁在一起的4个基因转化水稻光温敏核不育系7001S。通过基因枪转化法轰击1160块的愈伤组织得到167株再生植株，转化率17.4％。通过农杆菌介导转化法侵染270块的愈伤组织，获得6株再生植株，转化率2.2％。转基因再生植株的分子生物学鉴定表明，抗除草剂基因Epsps和抗虫基因已经整合到水稻基因组中，其拷贝数为1-2个。除出只有1～3个基因检出的植株，选出81个含有4个基因的转基因植株。部份植株中只含其中1～3个基因，可能是由于基因枪转化中部分片段发生丢失造成的。利用除草剂草甘膦处理含4个基因的转基因植株，它们表现出对草甘膦具有不同的抗性，推测是由于抗除草剂基因在不同个体中表达强弱不同所致。通过除草剂处理筛选，共获得具有草甘膦抗性且结实正常的转基因再生植株53株。

目录

论文说明：英文缩写词表

声明

摘要

1引言

1.1水稻抗虫基因工程的研究进展

1.1.1 苏云金杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白基因

1.1.2 蛋白酶抑制剂基因

1.1.3外源凝集素基因

1.2草甘膦及其抗性植物研究进展

1.2.1 草甘膦的作用机理

1.2.2 EPSPS合成酶编码基因的研究进展

1.2.3利用基因工程方法获得草甘膦抗性植物的研究

1.2.4 EPSPS酶基因在作物遗传育种上的应用前景

1.3多基因转化策略在水稻转化中的研究应用

1.3.1 多基因抗性表达载体的构建

1.3.2 多基因转化策略的方法

1.4本研究的目的和意义

1.4.1本研究的目的

1.4.2本研究的意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株

2.1.3质粒

2.1.4主要试剂

2.1.5 主要仪器

2.2实验试剂

2.2.1培养基的配制

2.2.2常用的缓冲液和试剂成分的配制

2.3实验方法

2.3.1 载体构建

2.3.2水稻愈伤组织的遗传转化

2.3.3转基因植株的分子检测

3实验结果与分析

3.1以Epsps为筛选标记的多价抗虫基因表达载体的构建

3.1.1 中间载体pCTSM1300的构建

3.1.2中间载体pCT-PinⅡ-1的构建

3.1.3 中间载体pCT-Bt-2的构建

3.1.4载体pCTSKC3的构建

3.1.5大分子连接反应中的各组实验方案对比结果分析

3.2转抗草甘膦基因和多个抗虫基因水稻植株的获得

3.2.1水稻愈伤组织的诱导

3.2.2水稻愈伤组织的转化——基因枪法

3.2.3水稻愈伤组织的转化——农杆菌介导法

3.3转基因植株的分子生物学鉴定

3.3.1 R0代转基因植株的PCR分析

3.3.2 R0代转基因植株的PCR-Southern blot分析

3.3.3 R0代转基因植株的Southem blot分析

3.4转基因植株的草甘膦抗性鉴定

3.4.1盆栽转基因植株离体叶片的草甘膦抗性试验

3.4.2盆栽植株叶片草甘膦涂抹抗性试验分析

3.4.3盆栽植株整株喷洒草甘膦抗性试验分析

4讨论

4.1多基因转化效率与转化方法的研究

4.2启动子与基因高效表达的研究

4.3转基因植株拷贝数检测方法的探讨

5结论

参考文献

附 录

致 谢

攻读学位期间发表论文的情况