早实核桃(Juglans regia L.)花器官变异及花发育相关基因克隆研究

摘要

在普通核桃(Juglans regia L.)中存在着一类播种后1～2年就能开花结实的早实类群。本研究通过对不同杂交组合后代早实单株的开花结实特性的观察，研究了早实核桃花器官变异特性：以早实核桃花芽为材料，同源序列法克隆了jrAP1(jrAPATALLA1)基因全序列和jrSEP1(jrSEPALLATA1)、jrNEF1(jrNOEXINEFORMATION1)的部分片段。以期从分子水平揭示核桃早实特性的机理，为加速核桃育种进程，促进核桃产业化栽培和研究木本植物童期决定的因素提供理论依据。具体研究结果如下： 1.早实核桃花器官变异研究用6个早实核桃材料和2个晚实核桃材料作亲本，选配10个杂交组合，以得到的2942个实生杂种苗为材料，观察核桃花器官变异类型及其特点，制作石蜡切片对两性花变异类型的花芽分化进程进行研究。在具有早实核桃为亲本的杂交组合和早实核桃自然授粉的2648株实生单株中，到播种后第3a累计结实实率为20.34％，晚实核桃294株实生后代无早结果现象。在538株早实杂种苗中，共有12个单株在2a生时发生了花器变异，变异类型包括两性花类型、穗状花类型、穗状花具分枝类型、穗状花雌雄同序类型、柱头变异类型和雌花序莲座状六种类型。连续5年观察表明，仅有来自于新1号×香玲杂交组合的C3单株二次花的雌雄同花变异在不同年份稳定表现。在一些早实品种(如香玲)的徒长枝上也具有两性花变异。核桃两性花变异的形态发育进程属于向心式：花序原基-花原基-花被原基-雄蕊原基-雌蕊原基-子房原基。核桃的花器官变异是在早实核桃二次开花过程中发生的。 2.核桃早实性状相关基因同源序列克隆本研究根据多种植物MADS-box基因保守区序列设计简并引物，从早实核桃花芽中提取总RNA，应用RT-PCR技术，结合3'RACE和5'RACE获得jrAP1基因全序列，全长为923bp，序列分析表明jrAP1与白桦、桉树的MADS-box基因具有较高的同源性(同源性分别为76％、62％)。还获得jrSEP1、jrNEF1部分片段。jrSEP1片段长112bp，与板栗、大豆、桃树的MADS-box基因具有较高的同源性(同源性分别为92％、92％、88％)；jrNEF1片段长度为1514bp，与调控葡萄、杨树、拟南芥花粉壁形成的基因具有较高的同源性(同源性分别为88％、83％、89％)。系统发育分析将jrAP1归入MADS-box基因家族AP1亚家族，将jrSEP1归入MADS-box基因家族SEP1亚家族，jrNEF1是调控花粉壁的形成的一类基因。探讨了jrAP1基因和jrSEP1、jrNEF1基因片段与核桃早实特性和核桃花器官发育的关系。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1引言

1.1开花决定

1.1.1光周期途径

1.1.2春化作用途径

1.1.3自主途径

1.1.4赤霉素(GA)途径

1.1.5成花抑制途径

1.2花的发端

1.3.花发育的ABC模型及其发展

1.3.1花发育的ABC模型

1.3.2花发育的ABCD模型

1.3.3花发育的ABCDE模型

1.3.4花发育的四聚体模型

1.4 MADS-box基因研究进展

1.4.1 MADS-box基因的分布及其结构特点

1.4.2 MADS-box基因功能的多样性

1.4.3 AP1-like亚家族(A类)研究概况

1.4.4 SEP-like亚家族(E类)研究概况

1.4.5 NEF1(NO EXIN FORMATION1)研究概况

1.5木本植物花发育相关基因研究进展

1.6核桃早实特性及生物技术在核桃上的应用进展

1.7本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株和载体

2.1.3生化及分子生物学试剂

2.1.4寡核苷酸引物合成

2.2方法

2.2.1花器变异观察方法

2.2.2石蜡切片材料取样方法

2.2.3石蜡切片的制作方法

2.2.4植物总RNA的提取

2.2.5 RNA的甲醛变性凝胶电泳

2.2.6反转录

2.2.7聚合酶链式反应(RT-PCR扩增)和3’-RACE扩增

2.2.8 5’-RACE扩增

2.2.9 PCR产物回收

2.2.10连接反应

2.2.11大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.12连接产物转化大肠杆菌

2.2.13提取质粒DNA

2.2.14重组质粒鉴定

2.2.15序列测定

3.结果与分析

3.1核桃花器管观察结果

3.1.1核桃早实特性观察结果

3.1.2核桃花器官变异类型观察结果

3.1.3花器官变异类型特性的观察结果

3.2基因的分离与序列分析

3.2.1基因的分离

3.2.2基因序列及所编码蛋白的分析

3.2.3jrAP1基因编码的蛋白功能分析

4讨论

4.1早实核桃花器官的变异

4.2早实核桃成花相关基因序列的克隆

4.2.1核桃jrAP1基因的克隆

4.2.2核桃jrSEP1部分序列的克隆

4.2.3核桃jrNEF1部分序列的克隆

5结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况