棉花金属硫蛋白基因GhMT3α的功能分析及拟南芥与水稻蛋白质磷酸酶PP2C基因家族分析

摘要

非生物胁迫是影响植物生长发育和产量的重要环境因素，而其中又以干旱、低温和盐渍的影响最为严重。植物在长期的进化过程中形成了一套主动的防御机制，能够识别逆境信息并通过信号传递最终调节植物的生长发育，从而抵御不良环境的影响。植物在逆境下通常伴随大量活性氧(ROS)的产生。一方面活性氧自由基作为信号分子有效地传递逆境信号，另一方面活性氧自由基水平的升高又会对植物造成伤害。目前，关于活性氧自由基介导的基因调控的研究很少，活性氧自由基在植物胁迫中的功能有待于进一步的探索。 金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类低分子量(6000～9000Da)、高Cys含量、具有金属结合能力的多肽，它具有独特的氨基酸排列顺序，即多肽的N端和C端具有两个富含Cys的金属结合结构域，其中的Cys按CXnC的方式排列。研究表明在动物和真菌中MT在很多生理过程中发挥作用，包括细胞内激素平衡、氧化胁迫、离子伤害。近来，不断有研究证明植物MT也具有相似的功能。棉花是一种古老的纤维用经济作物，它具有广泛的应用价值和研究价值。本文以耐盐棉花品种中棉19(ZM19)为试验材料，通过反向northern差异筛选法从盐诱导棉花幼苗叶片cDNA文库中分离得到了一个与胁迫相关的克隆，通过序列比对发现该基因编码一种金属硫蛋白，命名为GhMT3a。并对该基因的功能和分子机制进行了探索。 蛋白磷酸酯酶2C(PP2C)是蛋白磷酸酯酶中的一大类，广泛参与逆境信号的传递过程。迄今为止，对植物PP2C蛋白的研究只是局限于个别基因的鉴定与功能分析，没有研究从基因组水平对此基因家族进行分析。拟南芥和水稻的基因组测序的完成为全面的分析和对比双子叶和单子叶植物基因家族提供了条件。本研究中以已知PP2C基因的序列作为检索条件，利用BLAST查找其同源序列，检索了模式植物拟南芥和水稻的基因组，获得编码PP2C蛋白的基因。得到的结果用SMART或者Pfam检测序列中的PP2C元件，最后从拟南芥和水稻基因组中分别鉴定到80个和78个PP2C基因。在此基础上，我们做了基因家族的分类、染色体的定位、表达模式分析以及基因上游调控序列等方面的研究。主要结果如下： 1.通过反向northern差异筛选盐胁迫诱导棉花幼苗叶片cDNA文库获得的一个编码63个氨基酸的基因。该基因编码蛋白与植物中金属硫蛋白具有很高的同源性，具有典型的植物3类金属硫蛋白序列特点，命名GhMT3a。 2.Northern blot表达分析表明GhMT3a能被NaCl、低温、干旱、CuSO4、ZnSO4、百草枯(PQ)、过氧化氢(H2O2)、ABA和乙烯等多种胁迫及激素信号诱导表达，而抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)能够有效的抑制NaCl、低温、干旱胁迫对GhMT3a诱导。对过氧化氢相对水平的测定结果表明NAC能够有效地降低NaCl、低温、干旱胁迫条件下棉花幼苗中ROS水平。这些结果说明GhMT3a具有金属硫蛋白受重金属诱导的功能，ROS是非生物胁迫诱导GhMT3a表达的重要信号物质。 3.同野生型相比，过量表达GhMT3a的转基因烟草能在200、300 mM NaCl，4℃，25％PEG条件下更好的生长。而胁迫条件下，转基因烟草中的H2O2水平远低于野生型烟草。过量表达GhMT3a能够有效的提高转基因酵母对PQ和H2O2的抗性。这些结果说明GhMT3a能够在真核细胞内有效地清除ROS，维持ROS平衡从而提高植物对非生物胁迫的抗性。 4.对GhMT3a体外结合Zn2+能力的测定表明每个GhMT3a蛋白最多能结合5个锌离子，说明GhMT3a具有金属硫蛋白家族结合金属离子的特性。 5.利用BLAST同源检索分别从模式植物拟南芥和水稻中鉴定到80和78个PP2C基因。neighbor-joirting法分别构建拟南芥和水稻中PP2C基因家族的系统发生树，根据分支上的解靴带值将拟南芥与水稻的PP2C家族分别分为13与11个亚家族，基因结构和蛋白质元件分析结果都支持这一分类。对拟南芥和水稻中PP2C基因的对比分析表明拟南芥的PP2C13个亚家族在水稻PP2C家族中都能找到同源基因，说明植物中PP2C各个亚家族在单子叶和双子叶植物分化之前已经形成。 6.利用网络数据库分别将拟南芥和水稻中的PP2C基因在染色体上进行了定位。通过对复制区域的PP2C基因的分析与对比发现，基因组加倍事件对单子叶和双子叶PP2C基因家族的形成都发挥了重大的作用。但是，基因的串联复制对水稻中的PP2C基因家族的形成的影响更为明显。 7.利用MEME元件分析工具对拟南芥和水稻中的PP2C基因家族分析获得11个保守的元件序列。大部分元件广泛分布PP2C基因家族成员中。而个别元件仅仅存在于少数几个亚家族中。这种差异为研究不同亚家族之间功能的差别提供了线索。 8.利用Genevestigator，MPSS和EST的公共数据库资源统计了拟南芥中PP2C基因的组织表达模式。根据表达模式的差异可以将PP2C基因分为三类，第一类的基因在四种检测的组织中都有表达，这类基因在拟南芥中有49个，第二类包括拟南芥中的28个基因，这些基因只在部分组织中表达；第三类的基因是组织特异表达的基因，包括3个拟南芥中的PP2C基因。同样，根据表达模式的差异，水稻中的PP2C基因也可以分为三类，分别包含27、45、6个PP2C成员。这些结果说明多数PP2C家族成员在植物发育的不同阶段发挥功能。 9.通过Genevestigator上的芯片数据分析拟南芥PP2C基因家族所有成员在ABA及数种胁迫信号条件下的表达模式。与其他亚家族不同，亚家族A所有成员都能够被ABA和数种胁迫信号诱导表达。RT-PCR实验表明ABA和胁迫处理条件下水稻亚家族A成员的表达也受到了明显的诱导。这些结果说明单子叶和双子叶植物中PP2C亚家族A的成员在ABA介导的胁迫信号传导中发挥着重要的作用。 10.利用网络数据库以及矩阵频率对拟南芥和水稻亚家族A中19个基因转录起始位点上游1000bp调控序列进行了详细的分析。结果表明它们都含有ABA响应元件(ABRE)，为这些基因在ABA信号途径中发挥功能提供了证据。其他调控元件，比如茉莉酸酮酯响应元件(TGACG motif)，在水稻和拟南芥中的分布存在显著差异，暗示单子叶和双子叶植物PP2C基因家族存在不同的调控模式。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写符号及中英文对照表

声明

1前言

1.1植物抗逆机理研究进展

1.1.1信号转导调节

1.1.2离子平衡和渗透调节

1.1.3胁迫相关蛋白

1.1.4抗氧化防御系统

1.2棉花基因克隆研究进展

1.2.1棉花抗逆相关基因的克隆

1.2.2棉花基因克隆的主要途径

1.3金属硫蛋白的研究进展

1.4蛋白磷酸酶的研究进展

1.4.1蛋白磷酸酶的发现

1.4.2蛋白磷酸酶的分类、结构及生化特性

1.4.3植物PP2C的功能

1.5生物信息学在基因家族研究中的应用

1.5.1生物信息学常用技术方法

1.5.2基因家族研究进展

1.6本课题研究的目的及意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料

2.1.2植物材料培养与处理

2.1.3实验引物

2.1.4软件和网络资源

2.1.5其他材料

2.2实验方法

2.2.1 RNA的提取

2.2.2 RNA的纯化

2.2.3 cDNA第一条链的合成

2.2.4双链cDNA的合成

2.2.5 DNA片段与克隆载体的连接

2.2.6大肠杆菌DH5a感受态的制备

2.2.7大肠杆菌细胞的转化

2.2.8质粒DNA的提取

2.2.9凝胶电泳中DNA片段的回收

2.2.10序列测定

2.2.11Northern杂交

2.2.12酵母表达载体的构建与酵母转化

2.2.13植物表达载体的构建

2.2.14农杆菌介导的烟草的转化

2.2.15原核表达及蛋白质纯化

2.2.16蛋白质结合金属离子能力的测定

2.2.17过氧化氢含量的测定

2.2.18 Clustal的使用

2.2.19 Phylip系统发育树

2.2.20 Mega3.1构建系统发生树的方法

2.2.21本地BLAST方法

3结果与分析

3.1 GhMT3a基因的获得与序列分析

3.2棉花金属硫蛋白GhMT3a的功能分析

3.2.1 GhMT3a内源表达分析

3.2.2 GhMT3a在烟草中表达及转基因烟草抗逆境胁迫分析

3.3 GhMT3a基因在酵母中表达及抗氧化检测

3.4 GhMT3a的原核诱导表达及GhMT3a体外结合锌离子能力的测定

3.4.1 GhMT3a基因的原核表达

3.4.2 GhMT3a蛋白与Zn2+结合检测

3.5拟南芥中PP2C基因的鉴定

3.6水稻中PP2C基因的鉴定

3.7拟南芥和水稻中PP2C基因家族的系统发生分析

3.8基因结构及蛋白质元件分析

3.9拟南芥和水稻中PP2C基因家族的比较分析

3.10拟南芥和水稻中PP2C基因的分布

3.11拟南芥和水稻中PP2C基因的表达模式

3.11.1 PP2C基因的组织表达模式

3.11.2 PP2C基因胁迫条件下的表达模式

3.12拟南芥和水稻亚家族A基因的上游调控序列分析

4讨论

4.1 GhMT3a的结构与功能

4.2 GhMT3a的信号传导途径

4.3 GhMT3a及其同源家族的应用前景及工作展望

4.4 PP2C家族是蛋白质磷酸酶家族的一大类

4.5 PP2C基因家族组织表达模式

4.6 PP2C基因家族的功能

5结论

6参考文献

7附录

致谢

攻读学位期间论文及专利