医院环境微生物气溶胶含量与传播及其指示菌耐药性的分子鉴定

摘要

微生物是医院获得性感染的主要因素，医院环境的生物污染可以引起一系列传染病的爆发流行。近几年的研究表明，一些气载病原微生物能够通过空气传播造成传染病的流行。过去对医院环境微生物气溶胶的传播主要是通过培养皿的自然沉降法检测细菌浓度的变化以及细菌耐药性及某些致病菌含量等方面来确认的。然而，未能证明医院病房环境、门诊房间内外环境分离的微生物气溶胶的起源及其同源性，未能用国际上通用的ANDERSEN-6采样器等来测定气溶胶微生物的含量等。因此，本课题测量了ICU病房、门诊注射室空气环境(5个医院的ICU病房环境及楼道、门诊注射室3个房间及走廊和大厅)的气载需氧菌的含量，在此基础上，(1)统计ICU病房环境、门诊注射室环境气载大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的含量；(2)对从ICU病房环境分离的87株气载大肠杆菌的耐药性及其ESBLs耐药基因的进行了检测：(3)采用分子生物学方法(ERIC-PCR)对ICU病房和门诊注射室空气环境中不同地点分离到的共131株大肠杆菌(其中病房87株、门诊44株)的遗传相似性进行聚类图的比较；(4)采用血清学分型方法，进一步对从门诊注射室环境、ICU病房环境及周围空气环境中分离的131株大肠杆菌同时进行了4组致病性因子的鉴定；(5)结合RFLP、PFGE、流式细胞仪技术(flow cytometer，FCM)对大肠杆菌的耐药性、耐药异质性进行了检测。通过膜联蛋白V(Annexin V)和PI(propidium iodide)的双染色，做了细菌凋亡(apoptosis)的研究探讨。根据以上研究结果，评估了医院环境微生物气溶胶的危害性及其向环境中的传播。 1、ICU病房、门诊注射室环境气载需氧菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的含量 本试验采用ANDERSEN-6级空气微生物样品收集器和RCS离心式采样器在5个医院的ICU病房环境及距病房环境5m、10m的走廊和大厅，一个医院门诊注射室环境的3个房间及其公共走廊和大厅的不同距离收集气溶胶微生物，一方面，通过对医院环境中气载需氧菌含量、气载大肠杆菌含量、气载金黄色葡萄球菌含量的检测，以及它们在ANDERSEN六级采样器上的分布规律来推断其对病人及医务工作人员自身可能造成的危害，从而使人们对医院空气环境中产生的微生物气溶胶及其健康威胁的高度重视。研究结果表明，5个病房环境内总的需氧菌含量和可吸入的需氧菌含量平均分别为126.8和70.38 CFU/m3空气。可吸入的需氧菌与需氧菌总的含量之比在47.9～70.2％之间，并且在5个病房环境内所检测的结果并没有很大差异(p>0.05)。5个ICU病房环境内总的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌含量分别为63和96 CFU/m3空气；可吸入的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌含量分别为43和81 CFU/m3。而且，每一个ICU病房环境内气载大肠杆菌和气载金黄色葡萄球菌的含量差异极显著(p<0.01)。在5个病房环境内可吸入的金黄色葡萄球菌含量占总的金黄色葡萄球菌含量的比例在59.8～79.2％之间，而且它们之间并没有显著差异(p>0.05)。门诊注射室环境气载需氧菌和大肠杆菌在五个采样点(Room A、B、C、Comdor、Hill)的浓度分别是211和18 CFU/m3；206和18CFU/m3：304和13 CFU/m3；567和22 CFU/m3；651和18 CFU/m3。走廊和大厅中需氧菌和可吸入的需氧菌浓度明显高于房间内的(p<0.05)。气载需氧菌中主要以葡萄球菌属和埃希氏菌属为主，其中革兰氏阴性菌占需氧菌总数40.08％～46.98％。 2、ERIC-PCR对医院空气环境中气载大肠杆菌向室外环境传播的鉴定 本课题测定了5个ICU病房和1个注射室及其公共走廊和大厅不同距离的空气环境中大肠杆菌含量，在细菌学鉴定的基础上，采用ERIC-PCR方法对不同地点分离到的大肠杆菌鉴定其同源性，获得大肠杆菌ERIC片段指纹图谱，通过该片段在细菌基因组内的数量和分布之间的关系，比较其遗传相似性，确定医院环境内微生物气溶胶向环境中的传播。ERIC-PCR结果表明，从ICU病房环境中分离到的大肠杆菌与距病房环境不同距离楼道内(5m和10m)分离到的40株大肠杆菌相似性可达100％，22株大肠杆菌的相似性在90％以上；从注射室环境三个房间、公共走廊和大厅内分离到的大肠杆菌10株相似性可达100％，18株大肠杆菌相似性在90％以上。由此，可得出结论，ICU病房环境内和楼道内的分离到的大肠杆菌极有可能来源于病房环境内的同一菌株，注射室环境内，公共走廊和大厅内分离到的大肠杆菌也可能来源于同株大肠杆菌。说明源于医院环境内微生物气溶胶能够通过气体交换和人员的流动向周围环境传播，通过气象条件和人员流动传播到不同的距离，造成周围环境的空气污染，引起医院环境的获得性交叉感染。 3、医院空气环境中大肠杆菌的血清学分型 采用血清学分型的方法进一步对从门诊注射室和ICU病房及周围空气环境中分离的共131株大肠杆菌同时进行了4组致病性因子的血清学鉴定，一方面，可以验证各种引起婴幼儿腹泻的致病性大肠杆菌，是否通过医院环境中空气的传播，造成医院环境交叉感染；另一方面，为研究分离的131株大肠杆菌是否存在O111、O55、O26、O119、O127、O157：H7和O128等血清群已被确认为引起世界上许多国家婴儿腹泻爆发的致病因子。研究结果表明，通过血清学凝集试验，EPEC阳性的有27株，共有7种血清型，其中优势血清型O142:K86(B)12株、3株O26:60(B6)、3株O127a:K63(B8)、3株O44:K74(L)、3株O114:K90(B)、2株O125:K70(B15)、1株0111:K58(B4)；ETEC阳性有10株，有3种血清型，其中6株O25：K19(L)、2株O8:K40(A)K47、2株O78:K80；EIEC凝集的有9株，共有2种血清型，其中O112ac:K66有5株、4株O124:K72；未检到O157:H7。 4、医院ICU病房环境中大肠杆菌耐药性的检测及其超广谱β-内酰胺酶耐药基因的鉴定 通过对医院ICU病房环境及楼道空气中分离的87株大肠杆菌耐药性的调查、分析，进一步证明了医院环境中的大肠杆菌可以通过室内外气体的交换而相互传播，可能对周围环境及其周边病人、医务工作人员的健康构成潜在的威胁。同时还对87株医源性大肠杆菌的产超广谱p.内酰胺酶(Extended Spectyumβ-Lactamase，ESBLs)耐药基因(TEM、SHV、CTX-M)做了筛查。结果表明，大肠杆菌对青霉素类药物、加酶抑制剂的抗生素和碳青烯酶类抗生素、对第一、二、三、四代头孢类抗生素、单环类抗生素、氨基糖甙类抗生素、喹诺酮类药物有不同程度的耐药性。其中对青霉素类药物耐药率最高，对加酶抑制剂的抗生素和碳青烯酶类抗生素的敏感率最高。通过与ERIC-PCR的同源性比较，其同源性在100％的菌株其耐药菌谱也相同，进一步证明了医院环境中的气载大肠杆菌可通过空气传播，造成医源性的交叉感染。87株大肠杆菌的ESBLs耐药基因谱以TEM基因为主。 药敏试验结果还显示，大肠杆菌耐药率高，多重耐药菌株多，耐药菌谱宽，且与我们在取样时了解到的医院环境的日常药物使用情况相吻合，说明耐药性的产生可能是由于治疗过程中用药情况复杂，种类繁多，而且用药不合理，以及与大肠杆菌的耐药机制有关。 5、流式细胞仪检测大肠杆菌的耐药性及细菌的凋亡 采用流式细胞仪技术对分离的E.coli和25922标准菌株进行了氨苄西林和头孢噻肟的药物敏感试验；还通过PI(propidium iodide)和Annexin V双荧光染色技术，对E. coli的细菌凋亡进行了试验分析；另外结合RFLP、PFGE、流式细胞仪技术(flow cytometer，FCM)对Ecoli进行了的检测。研究结果表明，与抗生素共孵育后，PI染色E.coli的DNA，可以很准确的计算出其MIC值，从而可确认E.coli的药物敏感结果；与抗生素共孵育后可以在DNA直方图上正常二倍体细胞的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰(sub-G1峰，即AP峰，Apoptotic peak)，峰的面积代表凋亡细胞中的DNA含量。根据此亚二倍体峰面积，可以计算出凋亡细胞在总细胞数中的所占的百分比。利用PI和Annexin V的双染色，使用流式细胞仪检测能够可以区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞；结合RFLP、PFGE、流式细胞仪技术(FCM)不仅对大肠杆菌的耐药性、耐药异质性进行了快速、高灵敏的检测，还可以建立E.coli的指纹图谱、发现新菌株新亚型，这将对微生物领域的研究开辟新的技术平台。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章医院环境微生物气溶胶及其耐药性研究背景

1医院感染

1.1医院感染的现状

1.2医院感染的主要感染部位

1.3医院感染的主要科室

1.4医院感染的主要致病菌

1.5医院感染与气载细菌的关系

1.6医院感染与耐药菌的关系

2产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌的研究进展

3耐甲氧西林葡萄球菌的研究进展

4微生物气溶胶概述

4.1微生物气溶胶的特性

4.2微生物气溶胶医院感染形式

5微生物气溶胶的检测

5.1自然沉降法

5.2惯性撞击式采样法

5.3离心式采样器法

5.4其他采样器

6减少医院环境微生物气溶胶感染的措施

6.1空气消毒的重要性、难度和效果

6.2几种空气消毒法概述

6.3各种空气消毒方法的比较

6.4静电空气生物洁净

6.5过滤通风除菌

7研究的目的及意义

8本论文的整体构思和体系结构

第二章ICU、门诊注射室环境气载需氧菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检测

1引言

1.1Andersen-6级生物采样器概述

1.2工作原理

1.3本研究的历史背景

2材料与方法

2.1材料和仪器

2.2方法

3结果

3.1金黄色葡萄球菌双重PCR方法鉴定结果

3.2门诊注射室、ICU病房环境中气载需氧菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的含量

3.3气载需氧菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在Andersen各层级上的分布特征

4讨论

4.1大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对人体造成的危害

4.2微生物气溶胶的含量与人类疾病的关系

4.3门诊注射室革兰氏阴性菌菌群分析

4.4细菌气溶胶空气动力学分析

4.5气载金黄色葡萄球菌在医院获得性感染的重要性

4.6存在的缺点

5结论

第三章ERIC-PCR对ICU病房环境、门诊注射室环境气载大肠杆菌气溶胶的同源性的鉴定

1引言

1.1ERIC-PCR技术

1.2研究的目的及意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1不同医院ICU病房环境中分离到的大肠杆菌ERIC-PCR结果

3.2医院注射室环境中分离到的大肠杆菌ERIC-PCR结果

4讨论

4.1以大肠杆菌作为指示菌的依据

4.2ICU病房环境中大肠杆菌气溶胶向外环境的传播

4.3注射室环境中大肠杆菌气溶胶向外环境的传播

5结论

第四章医院内空气环境中E.coli的血清学分型

1引言

1.1致泻性大肠杆菌的致病特点

1.2大肠杆菌血清分型

1.3EPEC作为婴儿腹泻病原的早期证据

1.4EPEC性腹泻的发病机理

1.5本研究的目的及意义

2材料与方法

2.1肠道致病型大肠埃希氏菌诊断血清试剂

2.2 11种侵袭性大肠杆菌诊断血清

2.3 16种侵袭性、产毒性大肠埃希氏菌诊断血清

2.4 O157:H7诊断血清

2.5菌株来源

2.6血清学鉴定流程

3结果

4讨论

4.1引起爆发大流行的大肠杆菌的血清型

4.2 131株气载大肠杆菌的血清学分型

4.3致病性大肠埃希氏菌的流行现状

5结论

第五章医院ICU病房空气中大肠杆菌耐药性的检测及其超广谱β-内酰胺酶耐药基因的鉴定

1引言

1.1我国医源性大肠杆菌的耐药现状

1.2常用药物

1.3多重耐药与交叉耐药

1.4大肠杆菌产超广谱β内酰胺酶的耐药机制

1.5大肠杆菌耐药性的传播

1.6本研究的目的及意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1ICU病房A环境中大肠杆菌药敏试验结果

3.2ICU病房B环境中大肠杆菌药敏试验结果

3.3ICU病房C环境中大肠杆菌药敏试验结果

3.4ICU病房D环境中大肠杆菌药敏试验结果

3.5ICU病房E环境中大肠杆菌药敏试验结果

3.6 ICU五个病房空气环境87株大肠杆菌的耐药情况

3.7产ESBLs大肠埃希菌耐药率(％)

3.8ICU五个病房环境87株大肠杆菌的多重耐药情况

3.9ESBLs耐药基因的检测结果

4讨论

4.1医院ICU病房环境中大肠杆菌的耐药现状

4.2产ESBLs大肠杆菌国内外流行现状、特征及其治疗原则

4.3大肠杆菌的多重耐药性

5结论

第六章流式细胞仪检测大肠杆菌的耐药性和细菌凋亡

1引言

1.1流式细胞仪的一般原理

1.2流式细胞仪分析在微生物学中应用的原理

1.3RFLP的实验原理

1.4PFGE的实验原理

1.5流式细胞仪检测细菌凋亡

1.6研究的目的及意义

2材料与方法

2.1材料与仪器

2.2方法

3结果

3.1FCM检测细菌的耐药性

3.2流式细胞仪分析检测大肠杆菌的抗生素后效应

3.3流式细胞仪分析检测大肠杆菌耐药异质性

3.4FCM检测细菌凋亡

3.5FCM检测细菌的DNA倍体

4讨论

4.1流式细胞术在细菌免疫学中有着广泛的应用

4.2操作方面

4.3资料分析方面

4.4大肠杆菌的凋亡机理

4.5流式细胞仪在构建细菌指纹图谱鉴定细菌中的作用

4.6流式细胞仪在细胞凋亡中的应用价值

4.7细菌的耐药异质性

5结论

本论文的创新之处

References

致谢

附录1采样仪器

博士在读期间发表学术论文