抗体选择压作用下H9N2亚型禽流感病毒HA基因的变异

摘要

将本实验室分离保存的制备疫苗用的LG1株H9N2亚型AIV接种于SPF鸡胚增殖病毒。对其血凝素(HA)基因进行扩增、克隆，然后进行阳性克隆鉴定。序列测定表明，所扩增的HA基因全长1683 bp，编码560个氨基酸；该毒株的裂解位点的氨基酸序列为R-S-S-R，属于低致病力毒株。将该毒株与国内11个参考毒株的HA基因序列进行比较分析，结果表明，国内毒株属于欧亚种系DK/HK/Y280/97，在国内DK/HK/Y280/97群系中，各毒株之间的核苷酸与氨基酸同源率比较高，核苷酸同源率为91.7％～96.3％，氨基酸同源率为93.4％～96.1％，亲缘关系比较近；与北海道毒株核苷酸和氨基酸同源率分别为84.1％和91.2％，亲源关系比较远。 SPF来源的自来航鸡在开产前用LG1株H9N2亚型禽流感病毒制备的灭活油乳疫苗免疫接种二次，使其血清中对H9的血凝抑制抗体效价达到29。开产后收集受精蛋孵化，作为有H9母源抗体的鸡胚。同时用直接从同样品系的SPF鸡场取得的种蛋孵化，作为无H9母源抗体的鸡胚。将制备疫苗用的LG1株H9N2亚型AIV分别接种含有母源抗体鸡胚(A组)和不含有母源抗体的SPF鸡胚(B组)，并连续传代。其中A组再分为4个独立的传代系列A1-4，B组再分为2个独立传代系列B1-2。在每个传代系列，分别对第10，20，30，40，50代病毒的HA基因进行扩增克隆测序，并与原始病毒的序列比较。结果显示LG1株H9N2亚型禽流感病毒在没有抗体的SPF鸡胚的传代过程中，仅发生少数碱基的不稳定随机变异，且多为无义突变。在2个传代系列的10个代次病毒，共出现了29个位点变异，有义突变(NS)与无义突变(S)比值NS/S仅为1.42。但在有母源抗体的鸡胚的传代过程中，发生了多个呈现稳定遗传的有义突变。在4个传代系列的20个代次病毒，共出现了45个位点变异，有义突变(NS)与无义突变(S)比值NS/S为3.46，45个变异位点中有12个碱基位点在10-40代时发生的突变开始稳定下来，而且其中有9个碱基突变是有义突变，这9个位点分别位于＃17，＃313，＃477，＃496，＃592，＃593，＃672，＃796，＃806。 本实验结果证明了在鸡胚传代过程中，母源抗体提供的免疫选择压确实能影响H9N2的HA基因的变异。同时表明，带有母源抗体的鸡胚是实验室条件下研究抗体免疫选择压对病毒抗原性变异影响的一种有效并简单可行的实验模型。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

1前 言

1.1 H9N2亚型禽流感流行状况

1.2病原学

1.2.1 AIV的形态

1.2.2 AIV的基因组和病毒蛋白

1.2.3病毒复制

1.2.4 流感病毒的遗传变异

1.3禽流感的检测方法

1.3.1禽流感病毒的分离

1.3.2禽流感病毒的定

1.4禽流感的防制

1.5免疫选择压对病毒演化的影响

1.6本研究的目的及意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1病毒

2.1.2鸡胚来源

2.1.3主要试剂和仪器以及相关培养基和溶液的配置

2.1.4引物

2.2方法

2.2.1病毒的处理

2.2.2病毒RNA的提取

2.2.3 RY-CR扩增AIV cDNA

2.2.4 PCR反应

2.2.5凝胶回收DNA

2.2.6PCR产物与T载体的连接

2.2.7 PCR产物的克隆

2.2.8序列的测定

2.2.9 LG1株H9N2亚型禽流感HA基因序列比较分析

2.2.10绘制系统发育树

2.2.11传代系列HA基因核苷酸序列及NS／S比值的比较分析

3结果

3.1 PCR结果

3.2酶切结果

3.3 LG1株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的测定结果

3.3.1 LG1株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的核苷酸和推导的氨基酸序列

3.4抗体选择压作用下LG1株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的变异结果与分析

3.4.1传代序列HA基因的核苷酸和推导的氨基酸序列比较结果

3.4.2传代系列在有抗体的鸡胚传代的变异

3.4.3传代系列在无抗体的SPF鸡胚传代的变异

3.4.4抗体对H9-AIV传代过程中碱基突变的NS／S比值的影响

4讨论

4.1 LG1株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的测定

4.2抗体选择压作用下LG1株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的变异

主要结论

参考文献

个人简介

硕士期间发表论文情况

致谢