新城疫病毒气溶胶发生与传染机制及其在生产鸡舍环境中的监测

摘要

畜禽传染病如新城疫(Newcastle disease，ND)、禽流感(Avian Influenza，AI)、口蹄疫(Foot-and-Mouth disease，FMD)等疾病的病原都可以通过空气传播，造成传染病的流行。2002-2003年SARS和近几年来高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)的暴发流行，警示人们应重视病毒气溶胶及其气源性传染规律的研究。ND是危害最严重的家禽传染病之一，世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health，OIE)将其定为法定报告类疫病。然而，ND传播途径研究没能得到应有的重视。Gloster(1983)通过对两起ND爆发的分析，认为ND流行主要是由气载新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的：气源传播在新城疫流行中起着重要作用。这种传播方式在1970-1971年的英格兰ND爆发和1973年北爱尔兰ND流行中起了重要作用，并已经有证据证明NDV可发生远距离的传播。以上学者的观点尽管确认了ND的气源性传染途径，然而，NDV气溶胶的发生和传染机制不详，需要实验证明。因此，开展本研究。本课题建立了NDV气溶胶发生及传播感染的实验模型，动态检测了人工感染鸡NDV气溶胶排出的时间，浓度：验证NDV F48E9株可以通过气源传播感染健康鸡群。并进一步研究了感染NDV的鸡群排出的NDV气溶胶向周围环境扩散并感染10m、20m外的鸡群；对NDV气溶胶不同感染途径的感染剂量进行对比研究；在此基础上，收集生产鸡舍中的空气，对其中的NDV进行分子检测及分离鉴定，对气载NDV分离株的部分分子特性进行了研究；应用ERIC-PCR动态监测了感染NDV气溶胶SPF鸡肠道菌群的变化。本研究不仅对深入认识ND的传染机制非常必要，而且对揭示像SARs、禽流感等气源性传染病的传播机制带来有益的启示。 1、新城疫病毒气溶胶发生及其传染的实验研究 本实验建立一个NDV气溶胶发生、传播及感染的实验模型，进行实验1(T1)和实验2(T2)。隔离器A中的SPF鸡(G1)点眼、滴鼻接种NDV后用AGI-30收集A中的气体，检测气体样品中的NDV，用蚀斑计数法测定NDV气溶胶浓度；隔离器B中的SPF鸡(G2)接受气源性被动感染。定期收集实验鸡的口咽和泄殖腔拭子，检测拭子中的NDV，确定排毒情况；每7天收集实验鸡血液样品，应用HI-T检测抗体。试验结果发现：T1和T2分别在攻毒后第二天和第三天检测到NDV气溶胶，其浓度分别在第13天和第11天达到高峰，为1.69×104 PFU/m3空气和9.14×103 PFU/m3空气，到第40天NDV气溶胶浓度仍分别为6.98×103 PFU/m3空气和3.78×103 PFU/m3空气；T1G1和T2G1组鸡均在攻毒后第二天检测到排毒；T1G2组和T2G2组接受气源被动感染7天后检测分别有80％和60％的鸡排毒，抗体分别在感染后第7天和第14天呈阳性，为4.07和7.40，一直到第四十天均为阳性。 结果表明SPF鸡在感染NDV后三天内排出NDV，并能够很快形成气溶胶；NDV气溶胶能够感染健康鸡只。 2、新城疫病毒气溶胶向周围环境扩散感染的实验研究 共进行两组实验，一组是新城疫病毒气溶胶向周围环境扩散的实验研究；一组是10m，20m气源传播感染实验。扩散试验时设一组SPF鸡经点眼、滴鼻接种NDV后用AGI-30收集接种鸡处(S0)距离接种感染鸡10m(S10)、20m(S20)处中的气体，检测并定量气体样品中的NDV，揭示动物舍NDV气溶胶向周围环境的传播情形。结果表明，S0处气体样品中从接种后第3天开始检测到NDV，浓度在11天达到高峰，一直到第30天RT-PCR检测结果仍为阳性；S10处及S20处气体样品中均从接种后第5天开始检测到NDV，浓度在11-13天达到最大值，一直到第25天RT-PCR检测结果仍为阳性。感染试验时设三组试验鸡，分别为人工接种鸡(G0)，点眼、滴鼻接种NDV，在距离接种鸡10m(G10)、20m(G20)处SPF鸡接受气源感染的哨兵组鸡，通过检测哨兵组鸡的排毒及抗体来确定是否发生气源感染，具体检测方法同试验一。气源扩散感染试验结果表明G10及G20持续气源被动感染7后开始检测，均检测到排毒直到第28天仍然排毒。 结果表明SPF鸡在感染NDV后三天内排出NDV，并能够很快形成气溶胶，传播扩散到20m；NDV气溶胶能够感染10m、20m处健康鸡只。 3、SPF鸡经不同途经的感染剂量及致死剂量实验研究 本实验分别通过呼吸道(通过人工发生定量NDV气溶胶感染SPF鸡)、消化道(喂服)及肌肉注射途径定量感染NDV，通过检测鸡的特异性抗体判定鸡是否发生感染，ID50、LD50计算方法采用的加权直线回归法(Bliss法)。结果表明NDV气溶胶半数感染吸入剂量为30.53 PFU，95％置信区间为9.46098.54(PFU)；半数致死剂量为117.05 PFU，95％置信区间为23.71-577.92 PFU。NDV通过消化道半数感染灌服剂量为4419.78 PFU，95％置信区间为1095.34-17834.14(PFU)；半数致死剂量为44743.91PFL，95％置信区间为10161.62-197017.62(PFU)。NDV经肌肉注射途径半数感染注射剂量为16.63 PFU，95％置信区间为4.85-57.00(PFU)；半数致死剂量为69.60 PFU，95％置信区间为14.24-340.27(PFU)。 结果表明不同感染途径的致病性有差异，肌肉注射致病性最强，气溶胶次之，消化道最弱。 4、鸡舍中气载鸡新城疫病毒的检测及分离鉴定 本研究采用AGI-30气体收集器在五个大型鸡舍舍内收集气体(15份/舍)，同时采集鸡的气管和泄殖腔拭子，采用兼并引物RT-PCR检测气体样品和拭子中的新城疫病毒(NDV)，并鉴别NDV的毒力；同时分离、纯化气体样品中的NDV，用常规毒力学实验鉴别分离株的毒力。结果五个鸡舍中，在鸡舍A中，2份气体样品和4份口咽及泄殖腔拭子中检测到弱毒，均没检测到强毒。在鸡舍B中，7份气体样品和5份口咽及泄殖腔拭子中检测到弱毒，而仅在5份气体样品中检测到强毒；在鸡舍C中，6份气体样品和5份口咽及泄殖腔拭子中检测到弱毒，而仅在2份气体样品中检测到强毒；在鸡舍E中，7份气体样品和1份口咽及泄殖腔拭子中检测到弱毒，而在所有样品中均未检测到强毒。分离纯化后总共得到7株NDV，其中3株为强毒，4株为弱毒。在鸡舍A中得到一株弱毒YTCX08，在鸡舍B中得到一株强毒DZ07和一株弱毒DZ0702，在鸡舍C中得到2株强毒MH07和MH0702和1株弱毒MH0703，在鸡舍E中得到一株弱毒NY06。 结果表明兼并引物RT-PCR可快速、直接对气体样品进行检测及鉴别诊断，有助于ND的防治。 5、气载新城疫病毒野毒株F基因重要片段的克隆及遗传变异分析 根据已发表文献针对新城疫病毒(NDV)F基因序列设计了1对引物，对从气体中分离的7株NDV毒株的F基因重要功能区片段扩增进行了扩增和序列测定，并与多株已报道的NDV参考株相应片段进行序列比较，经遗传基因进行化树分析。结果表明，七株气载新城疫病毒分离株之间的同源性为79.3％-100％；氨基酸的同源性为77.4％-100％，分离到的四株野毒NY06、MH0703、YTCX08与DZ0702均属于基因II型，在裂解位点的氨基酸序列(111GGRQGRL117)与NDV弱毒株特征相符合；MH07属于基因Ⅸ型；DZ07、MH0702均属于基因VII型，这三株在裂解位点的氨基酸序列(111GRRQKRF17)与NDV强毒株特征相符合。 6、新城疫病毒气溶胶感染SPF鸡肠道菌群结构变化的研究 SPF鸡定量感染NDV气溶胶后，定期采集试验鸡的粪便，检测其中大肠杆菌的浓度变化，同时应用ERIC-PCR对肠道菌群结构进行了动态检测；同时对健康鸡进行同样研究作对比。结果表明，通过与对照组肠道大肠杆菌的检测比较，结果大肠杆菌在感染初期高于对照组(P<0.01)，而严重感染开始出现死亡时开始降低，明显低于对照组(P<0.01)，恢复期大肠杆菌总数开始回升，与对照组差异不显著(P>0.05)。ERIC-PCR结果比较发现NDV气溶胶感染组鸡只与同日龄对照组鸡肠道菌群的图谱间有一定的差异。在大多数鸡群出现临床症状(2-10天)菌群结构也发生了改变，在恢复期(10-15天)菌群重新建立，并有一个重新选择的过程，到完全恢复后菌群结构基本稳定。 结果表明感染NDV气溶胶后鸡群肠道菌群发生了改变，采用ERCI-PCR指纹图谱技术可以动态监测动物肠道菌群结构变化。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

1引言

1.1新城疫(Newcastle disease)研究进展

1.1.1 NDV病原特性

1.1.2毒株分类及临床症状

1.1.3 NDV的致病机理

1.1.4 ND的流行及影响流行的因素

1.1.5影响ND流行的因素

1.2畜禽病毒气溶胶研究进展

1.2.1病毒气溶胶的概念

1.2.2畜禽病毒气溶胶的来源及对畜禽生产的危害

1.2.3畜禽病毒气溶胶的特性

1.2.4病毒气溶胶的检测

1.2.5病毒气溶胶的国内外研究现状

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1新城疫病毒

2.1.2标准单因子阳性血清

2.1.3 SPF鸡胚

2.1.4实验鸡

2.1.5标准诊断试剂

2.1.6主要试剂及配制方法

2.1.7主要仪器设备

2.2方法

2.2.1新城疫病毒气溶胶发生及其传染的实验研究

2.2.2新城疫病毒气溶胶向周围环境扩散感染的实验研究

2.2.3 SPF鸡经不同途径的感染剂量及致死剂量实验研究

2.2.4生产鸡舍中气载鸡新城疫病毒的检测及分离鉴定

2.2.5气载新城疫病毒野毒株F基因重要片段的克隆及遗传变异分析

2.2.6新城疫病毒气溶胶感染SPF鸡肠道菌群结构变化的研究

3结果与分析

3.1新城疫病毒气溶胶发生及其传染的实验研究结果

3.1.1新城疫病毒气溶胶发生及其传染的实验隔离器A中NDV气溶胶发生及浓度

3.1.2新城疫病毒气溶胶发生及其传染的实验中实验鸡排毒动态检测

3.1.3新城疫病毒气溶胶发生及其传染的实验中实验鸡血清新城疫抗体(NDV-Ab)

3.1.4新城疫病毒气溶胶发生及其传染的实验临床观察和死后剖检结果

3.2新城疫病毒气溶胶向周围环境扩散感染的实验研究结果

3.2.1鸡舍中环境条件

3.2.2气体样品中NDV的浓度测定及RT-PCR检测

3.2.3两次实验攻毒组鸡排毒检测

3.2.4气源传播感染哨兵组鸡排毒检测

3.2.5各试验组抗体效价测定结果

3.3 SPF鸡经不同途径的感染剂量及致死剂量实验研究结果

3.3.1临床观察结果

3.3.2病理剖检主要变化与病死鸡NDV检测

3.3.3气溶胶感染及致死剂量实验结果

3.3.4经消化道感染感染及致死剂量实验结果

3.3.5肌肉注射途径感染及致死剂量实验结果

3.4生产鸡舍中气载鸡新城疫病毒的检测及分离鉴定

3.4.1鸡舍情况

3.4.2兼并引物RT-PCR检测气体样品和棉拭子中NDV

3.4.3气体样品中NDV的分离鉴定及毒力鉴定的生物学试验

3.5气载新城疫病毒野毒株F基因重要片段的克隆及遗传变异分析

3.5.1 F基因的RT-PCR结果

3.5.2重组质粒的酶切及PCR鉴定结果

3.5.3核苷酸同源性比较

3.5.4核苷酸序列推导的氨基酸序列比较

3.5.5 F基因遗传进化树的绘制及基因分型

3.6新城疫病毒气溶胶感染SPF鸡肠道菌群结构变化的研究

3.6.1临床症状及病、死记录

3.6.2健康SPF鸡与人工感染NDV鸡肠道大肠杆菌总数的检测

3.6.3对各组样品进行ERIC-PCR扩增的结果及其分析

4讨论

4.1人工感染SPF鸡NDV气溶胶的发生及其传播

4.2气源传播试验模型的建立

4.3畜禽舍微生物气溶胶向周围环境扩散传播感染的危害

4.4新城疫病毒气溶胶向周围环境中的扩散传播

4.5新城疫病毒气溶胶传播感染距离的试验研究

4.6NDV向周围环境扩散感染研究的不足和展望

4.7新城疫病毒的气溶胶感染效能研究

4.8新城疫病毒的不同途径感染剂量对比研究

4.9气载NDV的检测的重要性

4.10应用RT-PCR检测并鉴别NDV

4.11气载NDV的分子检测的应用前景

4.12国内外NDV基因型分布和流行动态

4.13 F蛋白裂解位点氨基酸序列与致病性的关系

4.14以粪便中大肠杆菌为指示菌研究鸡的肠道菌群的变化

4.15 ERIC-PCR及在肠道菌群分析中的应用

4.16鸡肠道菌群调控措施的研究及相关产品的研制

5结论

6参考文献

7附图

8致谢

9博士在读期间发表学术论文

10博士在读期间获奖情况