马铃薯L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶基因在番茄中的功能分析

摘要

抗坏血酸又称维生素C（L-ascorbic acid，AsA），是植物和大多数动物体内合成的一类含量丰富的己糖内酯化合物，是人类必须的一种维生素。由于人体缺乏合成AsA的能力，必须从蔬菜水果中获得，因此AsA含量成为衡量蔬菜营养品质的一项重要指标。AsA对于植物抵抗氧化胁迫、光合作用、光保护、细胞的生长和分裂、乙烯生物合成等诸多方面具有非常重要的生理作用。
　　 L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶（GalLDH）是催化植物AsA生物合成（L-半乳糖途径）的最后一步关键酶，对提高植物AsA含量，增强其抗逆境胁迫能力具有非常重要的作用。本实验研究了在高温和低温胁迫下以AsA为核心的抗氧化系统与番茄温度胁迫耐受能力的关系，并用农杆菌介导法将马铃薯GalLDH基因导入了番茄植株中，进一步研究了转基因番茄以AsA为核心的抗氧化系统和生长及果实品质的变化。研究结果如下：
　　 1.在高温（40℃，24h）和低温（4℃，24h）胁迫下，番茄叶片AsA、DHA和AsA+DHA含量和GalLDH、DHAR、APX、MDHAR及GR活性均明显高于25℃（CK）处理，H2O2含量始终明显高于CK，AsA/DHA始终明显低于CK，说明短时间（24h）高温和低温胁迫，番茄幼苗以AsA为核心的抗氧化系统功能明显增强，但长时间（36h）温度胁迫，AsA抗氧化系统的功能明显下降，导致H2O2的积累。说明以AsA为核心的抗氧化系统在温度胁迫中具有重要的作用。
　　 2.对PCR筛选出的转基因植株进行荧光定量PCR检测的结果表明：转GalLDH反义基因番茄株系T0-1、T0-2和T0-3的GalLDHmRNA相对表达量与未转化番茄植株相比分别降低29.08％、78.49％和64.08％，而转正义基因番茄株系T0-1、T0-2、T0-3和T0-4的GalLDHmRNA相对表达量与未转化番茄植株相比分别增加88.37％、32.17％、278.7％和175.31％。说明马铃薯GalLDH基因均以整合到番茄基因组上，成功获得了转马铃薯GalLDH基因的正义和反义番茄植株。
　　 3.T1代转反义GalLDH基因番茄植株叶片和果实中GalLDHmRNA相对表达量和GalLDH活性均明显降低，说明马铃薯GalLDH反义基因抑制了番茄叶片和果实GalLDH在转录水平的表达。
　　 4.T1代转反义GalLDH基因番茄叶片和果实中AsA、DHA和抗坏血酸库（AsA+DHA）含量和抗坏血酸氧化还原对（AsA/DHA）均显著减少；与AsA合成和代谢相关的酶类（APX、AAO、DHAR、MDHAR、GR）活性均明显降低。
　　 5.T1代转反义GalLDH基因番茄株系光和强度显著降低，有机酸含量明显增加，果实含糖量和糖酸比明显降低。

目录

文摘

英文文摘

1 引言

1.1 高等植物中AsA的生物合成

1.2 AsA在植物体内的氧化还原过程

1.3 植物体内AsA的降解

1.4 植物中AsA的转运

1.5 AsA在植物体内的生理功能

1.6 L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶（GalLDH）研究进展

1.7 本研究的目的意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 转基因植物材料

2.1.2 温度胁迫处理的材料

2.1.3 载体和菌株

2.1.4 所用培养基

2.1.5 PCR所用引物

2.2 试验方法

2.2.1 转基因再生番茄植株的获得

2.2.2 转基因番茄PCR和荧光定量PCR检测

2.2.3 筛选抗性T1代植株

2.2.4 番茄叶片和果实中抗氧化物质的含量和有关酶活性的测定

3 结果与分析

3.1 高低温胁迫对番茄叶片抗坏血酸代谢系统的影响

3.1.1 温度胁迫下AsA、DHA和AsA+DHA含量及AsA/DHA

3.1.2 温度胁迫下GalLDH活性

3.1.3 温度胁迫下APX活性

3.1.4 温度胁迫下MDHAR和DHAR活性

3.1.5 温度胁迫下GR活性

3.1.6 温度胁迫下H2O2含量

3.2 马铃薯L-半乳糖-1,4内酯脱氢酶基因在番茄中的表达效应

3.2.1 转基因番茄植株的分子检测

3.2.2 T1代转反义基因番茄植株的PCR检测

3.2.3 T1代转反义基因番茄植株的荧光定量PCR检测

3.2.4 转GalLDH反义基因对番茄GalLDH活性的影响

3.2.5 转GalLDH反义基因对番茄AsA、DHA和AsA+DHA含量及AsA/DHA的影响

3.2.6 转GalLDH反义基因对番茄APX和AAO活性的影响

3.2.7 转GalLDH反义基因对番茄DHAR和MDHAR活性的影响

3.2.8 转GalLDH反义基因对番茄GSH和GSSG活性的影响

3.2.9 转GalLDH反义基因对番茄GR活性的影响

3.2.10 转GalLDH反义基因对番茄叶绿素和光合作用的影响

3.2.11 转GalLDH反义基因对番茄株高和茎粗的影响

3.2.12 转GalLDH反义基因对番茄果实糖、酸的影响

4 讨论

4.2 GalLDH反义基因对番茄GalLDH活性和AsA含量的影响

4.3 GalLDH反义基因对番茄DHA含量和AsA/DHA的影响

4.4 GalLDH反义基因对番茄相关酶活性的影响

4.5 GalLDH反义基因对番茄谷胱甘肽系统的影响

4.6 GalLDH反义基因对番茄糖和酸的影响

5 结论

参考文献

附录

致 谢

攻读学位期间发表论文情况