山东部分地区祖代、父母代、商品代蛋鸡群禽白血病流行病学调查及病毒分离鉴定

摘要

自1988年Payne L等发现ALV-J以来，几乎在全世界的白羽肉鸡群中发现了此病。近十年来，蛋鸡品系中也出现ALV-J的感染，且地方品系鸡中ALV-J的感染也频见报道。而且，ALV-J发病出现了新的特点，一：发病日龄提前，感染范围增大；二：发病形式更是多种多样，同时出现了多种病毒的混合感染的现象，给防治带来的新的难题；三：血管瘤型ALV-J的出现，除导致髓细胞瘤的发生外，病鸡在外表皮肤、关节、毛囊或内脏等出现血泡或血洞，病鸡常因大量失血而死亡。
　　 本文为了解山东地区蛋鸡禽白血病（Avian Leukosis，AL）流行情况，从泰安、临沂、青岛、聊城等4个地区的祖代种鸡及其相应的父母代、商品代鸡场无菌采集1 827份血清（祖代鸡血清597份、父母代鸡血清710份、商品代鸡血清520份）和1 209份泄殖腔棉拭子（祖代鸡棉拭子597份、父母代鸡棉拭子460份、商品代鸡棉拭子152份）。通过ELISA试剂盒进行了ALV-J、ALV-AB抗体检测及P27抗原检测。检测结果显示，山东地区祖代种鸡未检测到ALV-J抗体，ALV-AB抗体检出率极低，仅为0.84％，但个别祖代鸡场P27抗原的阳性率较高，可能主要与不规范杂交扩繁导致内源性病毒感染有关，也不能排除免疫耐受感染因素；父母代种鸡ALV-J抗体水平均较高，明显高于ALV-AB抗体阳性水平，P27抗原的阳性率也有所升高；商品蛋鸡ALV-J及ALV-AB抗体水平明显高于父母代水平，但P27抗原阳性率未见明显增加。
　　 本研究在上述某商品代蛋鸡场采血时发现疑似血管瘤型病鸡，并且在其父母代及祖代鸡群中也发现疑似ALV病鸡。通过PCR、IFA及ELISA检测方法，从该具有血缘关系的祖代、父母代及商品代鸡中分离到共6株ALV-J，其中祖代、父母代中各分离到1株病毒，分别命名为SDDP1001株和SDDP1002株；商品代蛋鸡中分离到4株病毒，分别命名为SDDP1003株、SDDP1004株、SDDP1005株、SDDP1006株，在国内尚属首次。根据ALV-J原型毒株HPRS103设计一对特异性引物，扩增gp85基因，并与各亚群参考毒株序列核苷酸进行同源性分析，结果显示：分离自商品代蛋鸡的SDDP1003株、SDDP1004株、SDDP1006株和父母代分离株SDDP1002位于同一分支，同源性在97.2％-97.9％之间，与HPRS103株同源性94.7％-95.2％；SDDP1005与祖代分离株SDDP1001株在同一分支，与HPRS103株同源性为98.3％,4株分离自商品代的ALV-J同源性为95.0％-99.9％；6株病毒与A亚群代表株RAV-1A和B亚群代表株RAV-2 B的同源性仅在12.0％-12.8％之间，与E亚群代表株ev-1 E同源性为12.2％-12.4％之间。选取三株代表病毒（SDDP1001株、SDDP1002株和SDDP1006株）进行病毒的毒价及复制动力学特性分析，结果表明：分离自祖代的病毒株滴度最高，为105.59 TCID50/0.1ml，而父母代SDDP1002株和商品代SDDP1006株病毒滴度相近，分别为104.61 TCID50/0.1ml和104.71 TCID50/0.1ml，三株病毒具有相似的复制动力学曲线。等量三株病毒分别感染DF-1细胞，检测结果表明，等量病毒感染细胞后在相同时间内祖代SDDP1001株病毒上清中含有更高的感染性病毒。病毒分离结合ELISA（或者IFA）的检测方法是ALV-J感染的“金标准”，但是费时费力，而且 ELSIA检测试剂盒价格昂贵，不适用于鸡场进行大规模检测。此外，由于ALV-J感染细胞后不产生细胞病变，不能通过组织半数感染量对病毒进行定量。因此，为了更好进行临床样品的检测和实验室研究，需要建立一种快捷、简便、灵敏，并且能够的定量的ALV-J检测方法。本研究中针对pol基因和env基因结合处保守区域设计了一对特异性引物和一条探针，建立了TaqMan实时荧光定量PCR方法，通过对荧光定量PCR的反应体系和反应条件的摸索优化，使得其在101～1010copy/μl具有良好的线性关系。同时进行了重复性、特异性、敏感性试验，结果表明该方法重复性好，敏感性高，可检测初始模板中10个拷贝的病毒核酸，且不与其他禽病病毒发生非特异性反应。该方法的建立为ALV-J的早期快速诊断提供了一种简便、灵敏、快捷的检测方法。

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1 引 言

2 材料和方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结 论

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致 谢

攻读硕士学位期间撰写论文情况