犬H5N2流感病毒的分离鉴定及其分子生物学特征研究

摘要

本研究从56份临床症状表现为体温身高，咳嗽，流鼻涕的犬中分离到流感病毒，经血凝和血凝抑制试验以及BLAST analysis最终确定为H5N2亚型。根据Genbank中流感病毒H5N2亚型各个基因序列，分别设计扩增各基因片段的特异性引物，用RT-PCR方法扩增犬流感病毒(CIV)泰安分离株CA/SD/JT01/09各段基因，并分别将RT-PCR产物克隆入pMD18-T载体，进行测序分析。为了研究H5N2流感病毒在犬中的流行情况，随后采集并制备了了大量的犬血清进行抗体分析，从小部分的犬血清中成功分离得到了H5N2抗体。这表明了H5N2流感病毒能够在犬中传播。
　　 CA/SD/JT01/09 HA基因长度为1467bp，编码466个氨基酸，HA蛋白切割位点序列为PQ↓REIRRK，属于非高致病性毒株；分离段HA 含有4个氨基酸糖基化位点，分别为181-NNTD-,209-NPTT-,302-NSSM-，500-NGTY-，其中3个在HA1蛋白上，1个在HA2蛋白上，与个别参考毒株糖基化位点个数不同。CA/SD/JT01/09 HA蛋白在45、184、444位发生了氨基酸突变，但没有发生在HA重要的受体结合部位，其抗原性及其生物特性未发生变化；CA/SD/JT01/09 NA蛋白基因长为1172bp，编码388个氨基酸，包含4个氨基酸糖基化位点，其中第50和338位发生了氨基酸突变，导致NA颈部50位由V突变为A，可以推测对病毒的复制能力和宿主范围会产生一定的影响。NP基因分离长度为1594bp，编码499个氨基酸，其中与MD/Ita/36/2002(H5N3)的NP基因同源性最高，达到97％，分离毒株在339、376、461位的氨基酸分别为R、N、A，参考毒株为C、D、D。犬流感病毒CA/SD/JT01/09其余基因序列PB2、PB1、PA、M、NS片段扩增长度分别2174、2134、2062、1027、890，分别编码724、711、687、252、226个氨基酸，各个片段基因序列与参考毒株最高同源性都大于90％。
　　 系统发生分析表明，流感病毒CA/SD/JT01/09氨基酸序列与参考序列最大同源性均大于93.3％；其中HA基因与SW/FJ/F1/01(H5N1)的同源性最高，属于亚洲禽类谱系。NA蛋白与TK/WS/66(H9N2)同源性最高，亲缘关系最近，经分析表明NA基因属于早期北美禽类谱系。NP蛋白与SW/FJ/F1/01(H5N1)同源性最高，亲缘关系最近，属于欧洲谱系。其余片段均与SW/FJ/F1/01(H5N1)同源性最高，亲缘关系也最近。由此可以看出，该病毒基因来源比较复杂，所以该病毒可能是H5N1病毒与H9N2病毒的重组新病毒。
　　 这是世界上首次在犬中分离得到H5N2流感病毒，由于犬和人类的接触比较密切，CIV可能对人类的健康存在威胁，因此对犬流感的研究具有较深的公共卫生学意义。本实验成功分离并得到了H5N2流感病毒的8段基因序列，并对其基因序列和氨基酸序列以及同源性进行了分析，为进一步防治CIV的流行提供了重要的分子流行病学资料。

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5 结论

参考文献

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