马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA和人工的miRNA介导的病毒抗性的影响

摘要

基因沉默是生物体长期以来形成的一种防御机制，阻止外源基因、转座因子、病毒等外源核酸的侵入，保护生物基因组的完整性。小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子，是沉默RNA的最主要组成部分。RNA介导的病毒抗性（RNA-mediated virusresistance，RMVR）是RNA沉默的一种表现形式，侵入植物细胞的病毒基因组与转基因转录产物具有部分同源性，因此在转录后基因沉默所导致的RNA降解过程中，RNA降解系统识别侵入细胞内的病毒基因组并将其与转基因RNA一起降解。RMVR具有抗病程度高（近乎免疫）、抗性持久、生物安全性高等优点。在基因沉默的研究中已发现“位置效应”的存在，siRNA的有效性可能受到靶序列所处的位置影响。在RNA介导的植物病毒抗性研究中，目前尚未见有关“位置效应”的系统报道。本研究以马铃薯Y病毒外壳蛋白为靶基因分别以hpRNA和人工的miRNA两种方式构建RNA干扰的植物表达载体，系统性的比较PVY CP基因不同区段对RNA介导的病毒抗性的影响，为寻找引发基因沉默的有效片段及更好利用RMVR培育抗病毒转基因植物提供了依据。研究结果和主要结论如下：
　　 （1）马铃薯Y 病毒CP基因不同区段对发夹RNA 介导的病毒抗性的影响将PVY CP基因人工的划分为16 段各50bp的区段。通过PCR 扩增，得到相应的不同区段的正向和反向的片段，通过酶切连入植物表达载体pROKⅡ中；热激法转化大肠杆菌DH5α，筛选并获得hpRNA 结构的植物表达载体pROK-CPs（pROK-CP9～pROK-CP16）。
　　 用成功构建的16个植物表达载体（另外8个为吴斌构建）瞬时侵染本生烟验证其有效性，Northern Blot 结果显示，16个植物表达载体均能在植物体内成功表达产生siRNA，且瞬时表达的siRNA能有效地下调靶基因PVY CP的表达。
　　 将构建的8个植物表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89，经卡那霉素抗性筛选和PCR 检测确定转基因植株。T0 代转基因植株自交，种子置于含卡那霉素的筛选培养基上进行筛选，共得到的pROK-CP9～pROK-CP16 各50 株、62 株、56 株、55 株、45 株、63 株、72 株和55 株T1 代转基因植株。抗病性分析发现除了转基因株系pROK-CP1、pROK-CP2、pROK-CP3、pROK-CP4 未获得抗性植株外，其余12个转基因株系中抗性植株的比例分别为27.15％、6.27％、67.65％、70.83％、66.01％、61.34％、66.04％、23.59％、11.11％、55.56％、77.78％和67.25％。结果表明在利用hpRNA 介导的抗PVY 病毒的研究中，以PVY CP基因上的50bp序列为茎足以介导宿主植株的基因沉默的产生，但由于hpRNA 靶位置的差异产生不同的抗病效率，靶向于3′端nt701～nt750 区段表现最高水平的抗性；且以CP基因3′端为靶序列的hpRNA转基因植株比以5′端为靶序列的植株更能有效地介导对PVY的抗性。
　　 转基因植株的Northern 杂交分析表明，转基因都在RNA 水平上得到了表达，抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株，抗性与RNA 积累量呈负相关，证实病毒抗性是由RNA 介导的；对转基因植株的siRNA表达量的分析，表明植株对病毒的敏感程度与siRNA 积累量之间没有明显的相关性。
　　 对T2 代的转基因植株的抗病性分析结果发现，几乎所有的抗性转基因植株的后代均表现很强的抗病毒侵染能力，说明由hpRNA 介导的PVY 抗性在T2 代植株中能够稳定遗传。
　　 （2）马铃薯Y 病毒CP基因不同区段对人工的miRNA 介导的病毒抗性的影响以PVY CP基因的全长cDNA序列为靶基因，根据miRNA的特征选取8个不同的位置，M1（nt96～nt115）、M2（nt140～nt159）、M3（nt322～nt341）、M4（nt380～nt399）、M5（nt475～nt494）、M6（nt567～nt586）、M7（nt679～nt698）和M8（nt735～nt754）为amiRNA的靶区。选用拟南芥miR319a 前体作为amiRNA表达的骨架，通过PCR 扩增的方式替代掉原有的pre-miR319a中具有生物学功能的miRNA和miRNA*，得到含有amiRNA和amiRNA*的DNA片段。将扩增产物连入植物表达载体pROKⅡ中。热激法转化大肠杆菌DH5α，筛选并获得重组表达载体pROK-amiRcp1～pROK-amiRcp8。
　　 用构建的amiRNA表达载体瞬时侵染本生烟，Northern Blot 验证其有效性，结果显示,8个amiRNA 植物表达载体均能在植物体内成功表达amiRNA，且瞬时表达的amiRNA能有效地下调靶PVY CP基因的表达。
　　 将成功构建的amiRNA表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89。再生植株经卡那霉素抗性筛选和PCR 检测确定为转基因植株。T0 代自交后，经卡那霉素筛选和PCR 鉴定，分别获得pROK-amiRcp1～pROK-amiRcp8的T1 代转基因植株98 株、96 株、114 株、116 株、117 株、111 株、110 株和116 株。抗病性结果显示，表达靶向于马铃薯Y 病毒CP基因的amiRNA 转基因植株能介导对马铃薯Y 病毒的抗性，抗性比例分别为37.68％、50.29％、53.76％、37.75％、29.86％、17.05％、26.27％、64.69％。针对马铃薯Y 病毒CP基因不同区段设计的amiRcps 其转基因植株所介导的抗病性效果之间存在差异，靶向于3′端的amiRcp-8（nt735～nt754）能表现更高水平的抗性。
　　 转基因植株的Northern 杂交分析表明，转基因都在RNA 水平上得到了表达，且植株的抗性与转基因的表达量成负相关，表明amiRNA 介导的病毒抗性是由RNA 介导的。
　　 对转基因植株的amiRNA的Northern Blot分析，结果显示，所有抗病转基因植株中都有amiRNA 存在，且植株的抗性与amiRNA的表达量成正相关。
　　 对T2 代的转基因植株的抗病性分析结果发现，所有的抗性转基因植株的后代都表现高的抗病率，表明由amiRNA 介导的PVY 抗性在T2 代植株中能够稳定遗传。

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1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结论

参考文献

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