水稻酰基转移酶基因的克隆、功能分析及转AtMYB12基因番茄的获得

摘要

酰基转移酶是一个多功能蛋白质大家族,其功能具有多样性。其中一个主要功能就是催化蛋白质的酰基化和去酰基化:N-乙酰基转移酶(N-acetyltransferase,NAT)可催化乙酰基从乙酰CoA上转移到异烟肼的氮原子上;组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase,HDAC)分别催化组蛋白N-端残基上的乙酰化和去乙酰化,而酰基化和去酰基化又是真核生物蛋白质翻译后修饰中最普遍的方式,所以在某种意义上讲,酰基转移酶又有调节蛋白质生物活性、基因表达等多种功能。但是在机体内,有着多种酰基转移酶,除了催化蛋白质的酰基化和去酰基化外,还发挥着其他重要的功能,例如脂酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)所催化的胆固醇的酯化反应无论在细胞还是个体水平的胆固醇代谢平衡中都发挥了极其重要的作用。
　　 本研究的目的是分离克隆通过同源序列法鉴定的水稻中的BAHD酰基转移酶基因,并运用超量表达技术,RNA干涉(RNAi)技术,研究这些基因在水稻次生代谢、生物胁迫和非生物胁迫中的功能,对涉及到这些基因参与的水稻抗病抗逆机理进行初步探索。
　　 具体结果如下:
　　 1.分别克隆了Os02g39850全长cDNA、Os04g42250全长cDNA、Os06g08640全长cDNA、Os09g25460全长cDNA和Os10g3950全长cDNA。构建了植物表达载体ds1301:Os02g39850、pU1301:Os04g42250、ds1301:Os04g42250和ds1301:Os06g08640。将所构建的重组植物表达载体利用冻融法直接导入农杆菌EHA105。
　　 2.用农杆菌侵染的方法,将植物表达载体ds1301:Os02g39850、pU1301:Os04g42250、ds1301:Os04g42250和ds1301:Os06g08640转入水稻中。目前获得Os04g42250超量表达植株6株,Os04g42250抑制表达植株17株,超量表达载体转化水稻阳性率为75％,抑制表达载体转化水稻阳性率为44.7％。
　　 3.Os04g42250超量表达植株和抑制表达植株接种白叶枯病菌PX099,10天后,观察症状。其中7株抑制表达载体转基因植株的平均病斑长度为9.0±1.2 cm,而对照野生型中花11的平均病斑长度为5.0±0.6cm,4株超量表达载体转基因植株的平均病斑长度为1.3±0.3cm。这些结果说明,Os04g42250基因沉默后,植株更容易感病,发病症状更加明显,而Os04g42250基因在水稻中超量表达后,提高了植株的抗性。
　　 生物类黄酮具有多种生物活性,可用于延缓衰老,治疗和预防癌症、心血管病等疾病,具有很大的开发应用价值。当前满足市场需求的途径主要是通过化学方法从天然材料如银杏、水果中提取,其成本高,含量少。本研究拟通过。AtMYB12基因,果实特异性表达启动子E8和无选择标记载体PX6-GFP,构建植物表达载体pX6-AtMYB12-E8,来对小果型番茄进行基因工程改造,特异性调控表达基因AtMYB12,获得果实中超高表达植物类黄酮物质(芦丁和山奈酚芸香苷)和咖啡酰奎尼酸的转基因株系,达到适合经济工业化生产的需求,具有较高的市场开发与推广应用价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

1 水稻酰基转移酶基因的克隆、功能分析

1.1 引言

1.1.1 RNA沉默

1.1.2 酰基转移酶的研究现状

1.1.3 研究的目的意义和主要研究内容

1.2 材料与方法

1.2.1 材料

1.2.2 方法

1.3 结果与分析

1.3.1 目的片段的获得

1.3.2 表达载体的构建

1.3.3 农杆菌侵染及水稻组织培养

1.3.4 转基因植株的抗病性检测:

1.4 讨论

1.5 结论

2 转ATMYB12基因番茄的获得

2.1 引言

2.1.1 无选择标记

2.1.2 绿色荧光蛋白的性质

2.1.3 研究的目的意义和主要研究内容

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 方法

2.3 结果与分析

2.3.1 E8的TA克隆和E8-PX6的筛选及鉴定

2.3.2 ATMYB12-E8-PX6的筛选及鉴定

2.3.3 农杆菌侵染及水稻组织培养

2.3.4 转基因阳性植株的鉴定

2.4 讨论

参考文献

附录一

附录二 常用缓冲液及培养基的配制

附录三 常用化学试剂、分子生物学试剂

附录四

致谢