小鼠粗线期初级精母细胞与GV卵母细胞质重构卵母细胞的减数分裂

摘要

人类辅助生殖技术例如体外受精和胞质内单精注射技术应用的前提是患者能够产生具有受孕能力的卵母细胞或者精子，也就是说这些技术是无法治愈那些不能产生具有受孕能力配子的患者。因此人们考虑将体细胞进行单倍体化以产生人工配子。从理论上看，尽管有丝分裂和减数分裂存在有很大的差异，但是它们具有一些相同的机制。
　　 人们考虑使用减数分裂的细胞尤其是巨大的卵母细胞使体细胞核进行减数分裂产生单倍体人工配子。但是目前所有的尝试都是失败。小鼠粗线期初级精母细胞和GV 期卵母细胞均处于第一次减数分裂的前期，因此，和体细胞有丝分裂的各个时期相比，其更具有细胞周期上的优势，我们可以考虑使用显微操作技术用初级精母细胞的核来取代GV 期卵母细胞的核得到重构卵母细胞，通过研究这种重构卵母细胞减数分裂的各项指标，例如减数分裂的比例、染色体凝集与分离、MAPK 与MPF活性等，来分析使用GV 卵母细胞质作为受体细胞质对初级精母细胞遗传物质甚至体细胞遗传物质进行单倍体化的可行性。
　　 本研究使用昆明白小鼠作为实验动物，利用显微操作技术得到小鼠粗线期初级精母细胞与GV 卵母细胞质的重构卵母细胞（PS+GV 重构卵母细胞），研究了诸如成熟率、排极体的时间、极体的大小，细胞分裂激酶MPF和MAPK的活性等第一次减数分裂的各项事件；通过各项手段调控第一极体的形成；成熟后磷酸化MAPK的分布；染色体凝集和分离；纺锤体组装检验点活化的情况以及第一极体的退化和成熟重构卵母细胞的激活等。结果如下：
　　 1、这种重构卵母细胞能够发生第一次减数分裂；与GVT 卵母细胞成熟率没有差异，并且这两种卵母细胞的成熟时间没有差异，说明显微操作对这种卵母细胞的成熟没有造成显著影响。
　　 2、重构卵母细胞第一次减数分裂出现了大的第一极体；不同极体大小的重构卵母细胞的MPF和MAPK活性没有差异，其中MPF活性低于GVT 卵母细胞而MAPK活性与GVT卵母细胞没有差异。
　　 3、在重构卵母细胞成熟期间使用调控MAPK活性的药物冈田酸(OA)用于提高MAPK活性或U0126 用于降低MAPK活性的处理，均对重构卵母细胞第一极体的大小没有造成显著影响。
　　 4、显微操作时将供体初级精母细胞的核注射到GV 卵母细胞质的边缘和中间的两种重构卵母细胞第一极体的大小没有差异。
　　 5、重构卵母细胞成熟期间使用Nocodazole 延迟重构卵母细胞成熟时间并没有对大极体的比例造成影响。
　　 6、重构卵母细胞成熟6h 时微丝和皮质颗粒的分布与GVT 卵母细胞不同，GVT 卵母细胞在其DNA 附近皮质区形成了无皮质颗粒区(CGFD)和肌动蛋白富集的帽状结构，而重构卵母细胞的DNA 附近没有无皮质颗粒区和肌动蛋白帽状结构。
　　 7、重构卵母细胞染色体凝集发生了异常，染色质不能组装成正常结构的染色体,而GVT 卵母细胞染色体能够正常的凝集。
　　 8、重构卵母细胞第一次减数分裂期间染色体发生了不均等分离,而GVT 卵母细胞染色体能够均等分离。
　　 9、重构卵母细胞成熟期间出现了染色体桥的现象。
　　 10、成熟期间使用Nocodazole 处理，抑制了重构卵母细胞的成熟，而将Anti-Mad2 抗体的注射到重构卵母细胞内，加速了第一极体排出，说明重构卵母细胞SAC 没有发生异常。
　　 11、重构卵母细胞第一极体退化的比例为60％左右，主要发生在成熟后的12小时内，且大极体和小极体退化的比例没有差异。
　　 12、重构卵母细胞成熟后使用U0126 处理减少了其第一极体退化的比例。
　　 13、重构卵母细胞分裂时磷酸化的MAPK 发生了不均等分离。
　　 14、不同极体大小的重构卵母细胞中磷酸化的MAPK的不均等分离程度没有差异。
　　 15、成熟重构卵母细胞老化12h后使用SrCl2 激活的比例为60％。
　　 16、成熟重构卵母细胞孤雌激活后不能形成清晰可见的核膜。
　　 17、重构卵母细胞第一次减数分裂的分裂沟定位异常。
　　 总之，GV 卵母细胞的细胞核被初级精母细胞核取代的重构卵母细胞能够在体外成熟，但是产生了大的第一极体，并伴随着染色体凝集和分离的异常，但是这种染色体的相关异常并不是由SAC 异常造成的。成熟期间调控MAPK活性或者延迟成熟时间对第一极体的大小没有影响，而第一次减数分裂时染色体附近无法形成无皮质颗粒区和激动蛋白帽，说明重构卵母细胞第一次减数分裂纺锤体的迁移发生了异常。重构卵母细胞第一次减数分裂的分裂沟定位异常，从而影响分裂后产生的第一极体的大小，导致了染色质以及磷酸化的MAPK 无法均等分离，进而造成染色质和磷酸化的MAPK分离的异常。磷酸化的MAPK分离的异常造成了成熟重构卵母细胞中MAPK的量的差异，而造成极体退化和激活的异常。

目录

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1 前言

2 材料和方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结论

参考文献

7 致谢

8 个人简介