核桃与板栗内生真菌分离、生防潜力菌株的筛选及其生物学特性

摘要

本文以健康的核桃与板栗组织为试材，采用组织分离法对其根、茎、叶、果实等不同部位的内生真菌进行了分离与纯化，共得到内生真菌64株，其中从核桃上分离到36株，板栗上分离到28株。本文首先对内生菌的分离培养条件进行了探索。最后确定表面消毒方法为:酒精浸泡30s，无菌水冲洗2-3次，升汞浸泡2-3min，无菌水冲洗2-3次，无菌滤纸吸干表面水分。分离内生真菌的最佳培养基为PDA+链霉素培养基。将分离到的64株内生真菌与五种供试病原真菌，杨树腐烂病菌（Valsa sordida）、灰霉病菌（Botrytis cinerea）、板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）、立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）、核桃炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）进行了平板对峙试验，试验结果表明:有9种内生真菌对上述五种病原菌的抑制率均值达到50％以上，其中有3种内生真菌对每一种病原菌的抑制率都在50％以上。9种内生真菌挥发性物质的抑菌试验结果显示，其中有8种的挥发性物质对核桃炭疽病菌和板栗疫病菌都有抑制作用，而有一种对两种供试病原菌的生长有促进作用。9种内生真菌的液体培养发酵液对供试病原菌的菌丝生长、核桃炭疽病菌分生孢子和板栗疫病菌分生孢子的萌发都有明显的抑制作用。9种内生菌中的核桃内生菌的发酵液的温室促生试验和大田防病试验结果表明:发酵液对核桃苗的生长有明显的促进作用，在田间也能有效减轻核桃炭疽病的发生。发酵液经乙酸乙酯萃取和旋转蒸发得到的粗提物，对核桃炭疽病菌和板栗疫病菌的抑菌作用更明显。
　　 本文对部分内生真菌进行了形态学和分子生物学的鉴定。
　　 对3种生防效果最优秀的菌株，HL3R、HSE7和BR3进行了生物学特性的研究，对今后的大规模培养以及菌剂开发具有指导意义。在麦芽糖培养基、查彼培养基、基本培养基上，3种真菌均在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和基本培养基上的生长较好;3种真菌在15℃-35℃均能生长，20℃-30℃时生长较好，25℃时最适，生长速率最快，其中HSE7在30℃也能较好生长;蔗糖对三种内生真菌的生长有较明显的促进作用，其中BR3在乳糖为碳源的培养基上生长也较好;HSE7在含有无机氮源(NH4)2SO4和有机氮源丙氨酸的培养基上生长较好，HL3R在两种无机氮源(NH4)2SO4和NH4NO3的培养基上生长较好，而BR3在含有机氮源牛肉膏的培养基上生长较快。3种真菌对pH的适应范围较很广，在6～11的pH范围内都能生长良好，相比之下，在中性偏碱性的环境中生长最好;光周期对3种内生真菌的生长均没有显著影响;生长因子对3种真菌的生长没有促进作用，烟酸和VB2反而对BR3的生长产生抑制;微量元素的加入对它们的生长促进作用不是非常明显，只是对HL3R有一定促进，并未达到极显著的水平。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 植物内生真菌的研究概述

1．1．1 植物内生真菌的定义

1．1．2 植物内生真菌的起源和演化

1．1．3 植物内生真菌的多样性及主要类别

1．1．4 植物内生真菌生物学以及生态学特点

1．1．5 植物内生真菌对宿主植物的影响

1．2 研究植物内生真菌的方法

1．2．1 分离植物内生真菌的方法

1．2．2 植物内生真菌的种类鉴定

1．2．3 内生真菌的发酵和提取分离

1．3 内生真菌生物学特性研究

1．4 植物内生菌的研究中存在的问题

1．5 核桃与板栗概述

1．5．1 核桃的研究概况

1．5．2 板栗的研究概况

1．6 研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料试剂与仪器

2．1．1 植物样品来源

2．1．2 供试植物病原菌

2．1．3 供试培养基

2．1．4 主要试剂及仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 植物组织表面消毒

2．2．2 核桃与板栗内生真菌的分离与纯化

2．2．3 核桃与板栗内生真菌的鉴定

2．2．4 核桃与板栗内生真菌的生防活性的初步检测

2．2．5 初筛选的生防优势菌的进一步检测

2．2．6 三种内生菌的生物学特性的研究

3 结果与分析

3．1 核桃与板栗内生真菌的分离纯化结果

3．1．1 表面消毒方法的选择

3．1．2 表面消毒处理时间的选择

3．1．3 培养基的选择

3．2 核桃与板栗内生真菌的初步筛选

3．3 部分内生菌的鉴定

3．4 内生真菌挥发性物质的抑菌试验结果

3．5 内生真菌发酵液试验

3．5．1 平板抑菌试验结果

3．5．2 孢子萌发试验结果

3．5．3 核桃苗的温室促生结果

3．5．4 核桃炭疽病的大田防病结果

3．6 内生菌粗提物的平板检测结果

3．7 三种内生真菌的生物学特性

3．7．1 不同培养基对HSE7、HL3R和BR3三种内生真菌菌落生长的影响

3．7．2 不同温度对HSE7、HL3R和BR3三种内生真菌菌落生长的影响

3．7．3 不同光照条件对HSE7、HL3R和BR3三种内生真菌菌落生长的影响

3．7．4 不同 pH对HSE7、HL3R和BR3三种内生真菌菌落生长的影响

3．7．5 不同碳源对HSE7、HL3R和BR3三种内生真菌菌落生长的影响

3．7．6 不同氮源对HSE7、HL3R和BR3三种内生真菌菌落生长的影响

3．7．7 不同生长因子对HSE7、HL3R和BR3三种内生真菌菌落生长的影响

3．7．8 不同微量元素对HSE7、HL3R和BR3三种内生真菌菌落生长的影响

4 结论与讨论

4．1 结论

4．2 讨论

参考文献

致谢