转BADH基因植物的抗逆性与钙离子信号及热激蛋白的有关系

摘要

在非生物胁迫下，许多植物适应环境的重要机制就是积累一些低分子量的相容性物质，如甜菜碱(GB，Glycine betaine)、脯氨酸、可溶性糖等。其中甜菜碱是一种有特殊功效的相容性物质。甜菜碱在提高植物环境逆境（例如盐胁迫或高温胁迫）的抗性方面有重要作用，并且甜菜碱提高植物耐受性的同时伴随着热激蛋白(HSP, heat shockprotein)的积累。甜菜碱提高抗逆性与信号转导和离子稳态有关。
　　 本研究在前期工作基础上利用转BADH基因的烟草和番茄材料，结合外源甜菜碱处理的方法，分析甜菜碱的作用与不同的逆境胁迫及不同遗传背景的关系，探究转基因植物耐受性获得中与热激蛋白和钙-钙调蛋白信号途径的关系，甜菜碱提高光合性能以及甜菜碱对活性氧清除系统的作用。研究结果和主要结论如下:
　　 (1)利用非损伤微测技术，对外源甜菜碱处理和转BADH基因烟草（体内积累甜菜碱）进行钙离子(Ca2+)跨膜流速变化趋势的分析研究。实验结果表明:烟草根部的伸长区表皮细胞用NaC1处理后，产生一个瞬态Ca+外流，高峰值在1-2分钟内。甜菜碱可降低这种外流的峰值。提高NaCl(50-100mM)浓度后，峰值不再升高，Ca2+-ATPase抑制剂(Eosin Y，Eryth-B和CPA)也没有显著影响Ca+外流，表明这种瞬时的外流主要是细胞壁的阳离子交换;盐胁迫24小时后，Ca+呈现内流趋势，与此同时低浓度的甜菜碱显著增加NaC1诱导的Ca2+内流值。药理学实验结果表明，胁迫条件下甜菜碱可通过LaCl3敏感的钙离子通道加强Ca2+内流。
　　 (2)甜菜碱升高了胁迫下细胞内自由钙离子浓度([Ca2+]cyt)。激光共聚焦的实验结果证实，无论是外源还是内部合成甜菜碱都可适度升高胞质内自由钙离子浓度。非损伤微测技术和激光共聚焦的实验结果，从动态和静态两方面综合印证了盐胁迫条件下甜菜碱与钙离子之间的因果关系。
　　 (3)甜菜碱提高了非生物胁迫下的植物体内钙的积累。进一步研究甜菜碱对Ca+吸收的重要作用，对植物中的Ca2+含量进行分析比较表明，在长时间盐和高温胁迫下，甜菜碱预处理的和转基因植物中Ca2+含量明显高于野生型。
　　 (4)甜菜碱增强钙调蛋白(CaM)和热激因子(HSF)基因的表达，从而诱导HSP的积累。实时定量PCR实验，从基因表达层面证实甜菜碱与钙-钙调蛋白(Ca2+-CaM)以及HSP的因果关系。药理实验证实Ca2+和CaM增加了HSFs和HSP基因表达水平，HSP70的Western杂交结果也证实了HSP的积累。Western杂交的药理学实验，从蛋白层面证明甜菜碱可以通过Ca2+-CaM信号途径诱导热激蛋白HSP70的合成积累。结果表明:甜菜碱作为辅助因子增强盐或热胁迫下Ca2+的吸收，并通过Ca+-CaM的信号途径诱导HSP的转录和翻译。
　　 (5)甜菜碱降低活性氧(ROS)的积累。过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子自由基(O2-)在热激下积累，但是转BADH基因植株中积累量少于野生型。另一重要发现是外源添加甜菜碱在活体外不能清除H2O2和O2-，但酶抽提物能降低ROS的浓度，并且转基因植物中的明显清除能力强。这些结果表明在活体内积累甜菜碱不能直接清除ROS，而是通过体内的ROS清除系统发挥作用。
　　 (6)甜菜碱提高植物的抗氧化酶活性，减轻膜伤害的。转BADH基因植物的抗氧化酶活性高于野生型，相对电导率（REC）和丙二醛(MDA)的含量低于野生型，表明甜菜碱积累可提高抗氧化酶活性，减轻膜伤害。
　　 (7)甜菜碱提高ROS清除酶的基因表达，药理学实验证实Ca2+和CaM增加了CuSOD、APX1和CAT1基因的表达水平，从基因表达层面证实甜菜碱甜菜碱可以通过Ca2+-CaM途径影响一系列基因的表达。
　　 (8)甜菜碱提高植物逆境胁迫下的光合能力，减轻光抑制。在42℃热激条件下观测叶绿素荧光表明转基因植物比野生型有较高的光合能力。表明积累甜菜碱可减轻热激引起的光抑制。在盐胁迫下也有类似的结果。同时D1蛋白的Western杂交结果表明甜菜碱提高了D1蛋白的含量，加快D1蛋白的周转，加速PSII的修复。
　　 盐和高温是两种普遍的非生物胁迫，利用外源甜菜碱处理及两种转BADH基因材料，在非生物胁迫（高温和盐胁迫）下，研究甜菜碱在不同植物的遗传背景下的抗逆性机制，排除了材料差异和转基因事件引起的其他影响，更好地证实了甜菜碱的生物学功能。从钙信号转导、活性氧清除、光合机构的保护以及热激蛋白等相关基因表达等方面综合阐明:非生物胁迫产生活性氧的积累，形成变性蛋白，伤害细胞的正常生命活动，引起光合能力下降，影响生物量的积累。胁迫可引起Ca2+内流，[Ca2+]cyt适度升高，可以加快下游的信号转导，从而诱导HSP的转录，获得HSP的积累，减少伤害，是植物细胞一种积极的防御措施。甜菜碱的积累，无论是外源处理还是内部合成，都可加强这一信号，诱导胞质内钙离子浓度适度升高，并通过Ca2+-CaM的信号途径诱导较多HSP的转录和翻译，提高防御能力。甜菜碱通过钙离子信号系统，增加HSP的积累，发挥分子伴侣作用，帮助变性蛋白复性，减少变性蛋白的积累，从而提高植物抗逆性。另外甜菜碱可诱导活性氧清除酶的表达，提高抗氧化酶活性，减少活性氧的积累，从而减轻胁迫造成的伤害。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 甜菜碱与植物的抗逆性

1．1．1 甜菜碱对光合机构的保护作用

1．1．2 甜菜碱对活性氧清除系统的保护作用

1．1．3 甜菜碱可以维持生物膜的稳定性

1．1．4 甜菜碱可以影响基因表达水平

1．2 热激蛋白与植物的抗逆性

1．2．1 热激蛋白的分子伴侣作用

1．2．2 热激蛋白对光合机构的保护作用

1．3 甜菜碱和热激蛋白的关系及胁迫条件下细胞内信号交谈

1．3．1 甜菜碱和钙离子信号

1．3．2 钙离子信号诱导合成热激蛋白

1．3．3 钙离子与活性氧信号的交谈

1．4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 酶及生化试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 Real-Time PCR引物

2．1．5 植物材料培养与处理

2．2 实验方法

2．2．1 非损伤微测技术

2．2．2 激光共聚焦显微镜观察细胞内自由钙离子浓度的变化

2．2．3 钙含量的测定

2．2．4 Real-Time PCR

2．2．5 Western杂交检测

2．2．6 活性氧含量的测定

2．2．7 丙二醛含量和相对电导率的测定

2．2．8 抗氧化酶活性测定

2．2．9 光合性能的测定

2．2．10 甜菜碱含量的测定

2．3 统计分析

3 结果与分析

3．1 甜菜碱影响钙离子信号

3．1．1 扫点实验确定检测位点

3．1．2 盐胁迫下钙离子流的动力学趋势

3．1．3 甜菜碱促进了盐胁迫诱导的钙离子内流

3．1．4 甜菜碱提高细胞质内[Ca2+]cyt

3．1．5 甜菜碱提高了盐和高温胁迫下的植物体内钙的积累

3．2 甜菜碱和钙-钙调蛋白途径

3．2．1 盐胁迫和热激下甜菜碱增强植物中钙调蛋白的mRNA水平

3．2．2 胁迫下钙-钙调蛋白途径对热激蛋白表达的影响

3．2．3 甜菜碱可通过钙-钙调蛋白途径诱导HSP70的合成

3．3 甜菜碱与活性氧清除系统

3．3．1 胁迫条件下甜菜碱对活性氧积累的影响

3．3．2 甜菜碱不能直接清除活性氧

3．3．3 甜菜碱与活性氧清除酶系统

3．3．4 甜菜碱诱导抗氧化酶基因的表达

3．3．5 甜菜碱减轻膜损伤

3．4 甜菜碱对光合系统的保护作用

3．4．1 甜菜碱提高D1蛋白的含量

3．4．2 甜菜碱提高胁迫下的光合性能

3．4．3 甜菜碱提高PSⅡ的抗逆性涉及钙离子信号

4 讨论

4．1 甜菜碱增强了胁迫下的钙离子信号

4．2 甜菜碱提高HSP的积累涉及钙-钙调蛋白途径

4．3 甜菜碱提高活性氧的清除能力

4．4 甜菜碱提高了逆境下叶片PSⅡ的活性

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况