地方品系鸡白血病流行病学调查与ALVp27基因的表达分析

摘要

为了解地方品系鸡禽白血病的感染情况以及禽白血病的净化效果，本研究对莱芜黑鸡、百日鸡、芦花鸡、琅琊鸡、寿光鸡和石岐杂鸡六个地方品系鸡和经两个世代净化的B1、B3两个纯系鸡的禽白血病的抗原和血清进行了检测。结果表明:莱芜黑、百日、芦花、琅琊、寿光和石歧杂六个地方品系鸡蛋清P27抗原阳性率分别为60.33％、30.40％、37.63％、72.96％、42.11％、5.74％，公鸡泄殖腔棉拭子p27抗原阳性率分别为71.23％、44.30％、57.95％、45.83％、70.43％、14.88％，ALV-AB抗体阳性率分别为6.82％、7.81％、9.80％、8.57％、19.18％、13.13％，琅琊鸡和石岐杂鸡ALV-J抗体阳性率分别为1.43％、2.02％; B1、B3两个纯系鸡蛋清p27抗原阳性率分别为5.19％、3.34％，公鸡泄殖腔棉拭子p27抗原阳性率分别为20.51％、25.00％，其子代1日龄胎粪p27抗原阳性率分别为6.17％、1.38％。
　　 调查结果显示地方品系鸡不同品系之间禽白血病病毒阳性检出率差异较大，总体上禽白血病病毒阳性检出率明显较高，且公鸡泄殖腔棉拭子禽白血病病毒阳性检出率普遍高于母鸡，下一步应重点控制。经过净化的鸡群禽白血病病毒阳性检出率有明显的下降，J亚群禽白血病病毒得到有效净化，种群净化效果较为明显。本研究通过调查初步掌握了当前地方品系鸡禽白血病的感染情况及净化的效果，对下一步禽白血病的净化和控制提供了一定的理论依据和参考。
　　 对地方品系鸡p27抗原检测为阳性的鸡采集外周抗凝血，接种DF-1细胞，连续传代两次后，进行p27抗原ELISA检测和PCR检测，初步确认分离毒为ALV，将其命名为YZ株。为进一步分析其亚群，针对gp85设计特异性引物，进行扩增、克隆及测序，同源性分析结果表明YZ株与ALV-J代表株同源性在91.6％-94.3％，与ALV-AB、ALV-E代表株同源性较低，进化关系分析结果表明ALV-YZ与AF125527-J株的遗传距离最近，处于同一个分支。
　　 根据已发表序列设计一对特异性引物RT-PCR扩增ALV-YZ株p27基因，克隆至pMD18-T载体，定向插入到pET32a(+)表达载体上，构建了重组质粒pET-32a-p27。将构建的重组表达质粒转化受体菌BL21(DE3)，获得含有重组质粒的工程菌，进行IPTG诱导表达，诱导表达4h时表达量最高。SDS-PAGE电泳结果显示表达产物大小约为45KD，与预期结果大小相符。Western blotting鉴定结果表明，该融合蛋白能与ALV阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性。为下一步研制针对鸭、鹅等非鸡源的单抗和多抗，进行鸭、鹅等禽类禽白血病的感染和流行情况的调查奠定了基础。

目录

声明

符号说明

摘要

综述部分

1．1 概述

1．2 病毒病原学特性

1．3 病毒的基因组结构

1．4 病毒流行病学特性

1．5 禽白血病的病理学变化和免疫抑制作用

1．6 诊断方法

1．6．1 病毒的分离和鉴定

1．6．2 PCR技术

1．6．3 琼脂双向扩散试验

1．6．4 免疫组织化学技术

1．6．5 酶联免疫吸附试验(ELISA)

1．7 禽白血病的防控和种群净化

1．8 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 病毒、菌株及载体

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂及试剂盒等

2．2 方法

2．2．1 主要试剂的配制

2．2．2 地方品系鸡禽白血病流行病学调查

2．2．3 禽白血病病毒YZ株的分离与鉴定

2．2．4 禽白血病病毒p27基因的克隆与表达分析

3 结果与分析

3．1 地方品系鸡禽白血病流行病学调查

3．1．1 地方品系鸡的普查

3．1．2 纯系B1和B3的普查

3．2 禽白血病病毒YZ株的分离鉴定及序列分析

3．2．1 分离毒ELISA鉴定

3．2．2 分离毒PCR鉴定

3．2．3 gp85基因测序分析

3．3 禽白血病病毒p27基因的克隆与表达分析

3．3．1 p27基因的扩增

3．3．2 p27基因的克隆

3．3．3 表达载体的构建

3．3．4 重组菌的诱导表达

3．3．5 重组蛋白的纯化及Western blotting分析结果

4 讨论

4．1 地方鸡品系白血病流行病学调查

4．2 病毒分离和序列分析

4．3 p27基因的克隆表达分析

5 结论

参考文献

致谢