长期施用鸡粪农田土壤中典型抗生素耐药细菌及其抗性基因污染分析

摘要

近年来畜禽养殖中使用的抗生素的种类和数量增长迅速，养殖过程中抗生素的滥用使得大部分抗生素以原形或其代谢物随粪尿排出，造成动物粪便中抗生素的含量较高。富含抗生素的养殖场动物粪肥长期施用于农田，诱导产生了大量的抗生素耐药微生物及抗生素抗性基因(Antibiotics resistance gene，ARGs)，对农田土壤造成抗生素抗性污染。目前关于环境中ARGs污染的研究工作主要集中在水体污染及其生态效应方面，而对于土壤环境中抗生素抗性污染，尤其结合宏观表型及微观基因型的研究还较少。
　　本研究以长期施用化肥的土壤作为对照，对山东省泰安市、莱芜市部分地区的4个长期施用鸡粪的农田土壤样品中可培养细菌对土霉素（四环素类）、磺胺二甲嘧啶（磺胺类）、恩诺沙星（喹诺酮类）、泰乐菌素（大环内酯类）的耐药率进行了测定，并鉴定了农田土壤环境中筛选得到的各类抗生素耐药菌。同时利用PCR和Q-PCR技术对农田土壤环境中的ARGs的主要基因型及含量进行了研究，为山东省在全国范围内率先创建环境中抗生素耐药基因污染的监测体系奠定基础，将很大程度上促进山东省农业的可持续发展。主要研究结果如下:
　　(1)农田土壤微生物耐药率实验结果表明，长期施用鸡粪的农田土壤中各抗生素的耐药率明显高于对照土壤样品中各抗生素的耐药率;同种抗生素随着浓度增加，相应的土壤细菌对该抗生素的耐药率呈现逐渐降低的趋势;在各种抗生素选择培养浓度相同的条件下，土壤细菌对不同种类抗生素的耐药率不同，对照土壤中土霉素细菌耐药率为0，而泰乐菌素细菌耐药率(16.39％)最大。长期施用鸡粪的农田土壤中抗生素细菌耐药率大小依次为:磺胺二甲嘧啶(17.94％～59.97％)＞泰乐菌素(17.49％～52.42％)＞土霉素(8.29％～17.27％)＞恩诺沙星(0.65％～1.04％)。
　　(2)耐药微生物鉴定结果表明，分离、鉴定得到四环素类耐药菌4个属4个种，磺胺类耐药菌5个属10个种，喹诺酮类耐药菌10个属10个种，大环内酯类耐药菌11个属13个种;四环素类、磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类的优势耐药菌分别为沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微杆菌属（Microbacterium）和假单胞菌属（Pseudomonas）;土壤中存在肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、Microbacterium testaceum五种多重耐药菌。
　　(3)土壤中ARGs的PCR检测结果表明，与对照土壤相比，长期施用鸡粪的土壤中检出的ARGs的种类明显较多;其中检出频率较高的四环素类ARGs有tetO、tetW、tetT;检出频率较高的磺胺类ARGs有sul1，sul2;检出频率较高的大环内酯类ARGs有ermB、ermC;其中喹诺酮类四种抗性基因qepA、qnrA、qnrB、qnrS的检出频率相同。
　　(4)根据PCR定性检测结果，选取土壤中检出频率较高的tetO、tetW、tetY、sul1，sul2、ermB、ermC、qnrA、qnrS进行Q-PCR定量检测，结果表明，长期施用鸡粪的农田土壤中ARGs含量明显高于对照土壤中ARGs的含量;对照土壤CK以及长期施用粪肥的各土壤中各ARGs含量的大小均为:磺胺类＞四环素类＞大环内酯类＞喹诺酮类，其中sul2为定量检测的ARGs中含量最高的基因，含量高达6.6508×10-1。