中华蜜蜂硫氧还蛋白过氧化物酶、硫氧还蛋白和谷氧还蛋白相关基因功能分析

摘要

硫氧还蛋白过氧化物酶(Tpxs)、硫氧还蛋白(Trxs)和谷氧还蛋白(Grxs)作为生物体内重要的抗氧化酶，在维持氧化还原平衡和保护机体免受ROS损伤方面发挥着至关重要的作用。目前关于Tpxs、 Trxs和Grxs基因的研究主要在哺乳动物、果蝇等模式物种，中华蜜蜂(Apis cerana cerana)中关于此类基因的研究很少。中华蜜蜂是我国特有的种质资源，它耐寒抗病，在维持自然体系生态平衡方面发挥重要作用。然而由于环境污染、滥用杀虫剂和感染性疾病等使中华蜜蜂的生存环境变得越来越恶劣，因此保护中华蜜蜂这一重要的种质资源变得越来越紧迫。为了深入了解中华蜜蜂抗逆性作用机制，本研究从中华蜜蜂中克隆得到与抗氧化密切相关的五个新基因，并对它们进行了氨基酸序列比对、表达特性和功能分析，具体结果如下:
　　(1)从中华蜜蜂中分离得到Tpx-3、Trx2、Grx1、Grx2和Trx1基因，并分别命名为AccTpx-3、AccTrx2、AccGrx1、AccGrx2和AccTrx1，氨基酸序列比对、进化树和基因组结构分析发现以上中华蜜蜂抗氧化基因与意大利蜜蜂同类抗氧化基因的同源性较高，并且拥有高度保守的酶催化活性位点。
　　(2)利用qRT-PCR方法对中华蜜蜂以上五个基因在不同发育时期的表达特性进行了研究，研究结果表明，AccTpx-3在4日龄幼虫表达量最高，其次在15日龄成虫表达量较高;AccTrx2在15日龄成虫中表达量最高，其次在4日龄幼虫和黑眼蛹中表达量较高;AccGrx1、AccGrx2在黑眼蛹中表达量最高;AccTrx1在15日龄成虫表达量最高。
　　(3)利用qRT-PCR方法对中华蜜蜂以上五个基因在15日龄成虫不同组织部位的表达特性进行了研究，研究结果表明AccTpx-3、AccTrx2、AccGrx1、AccGrx2和AccTrx1分别在肌肉、脑部、脂肪体、肌肉和表皮中表达量最高。
　　(4)另外，采用qRT-PCR方法对以上五个基因在多种非生物氧化应激中的表达特性进行了分析，研究结果表明以上五个基因受温度、过氧化氢、农药等非生物应激处理诱导表达，说明以上五个基因参与抗氧化作用从而保护中华蜜蜂免受由ROS造成的氧化损伤。
　　(5)将在大肠杆菌中表达的AccTpx-3和AccTrx2进行纯化并经SDS-PAGE检测纯化效果后，利用MFO系统检测分析纯化蛋白功能，发现纯化的AccTpx-3和AccTrx2具有保护DNA免受ROS损伤的功能;另外在大肠杆菌BL21菌株中表达AccTpx-3可以减轻因百草枯导致的氧化损伤;纯化AccTrx2具有还原胰岛素的能力，说明其为典型的硫氧还蛋白。
　　(6)利用体外合成的dsRNA将AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx1分别成功沉默后发现中华蜜蜂体内的CAT、POD酶活性，过氧化氢、蛋白质羰基、维生素C含量，GSH/GSSG、NADP+/NADPH的比率均升高，说明有其他抗氧化相关基因参与弥补被沉默基因的功能缺失。
　　(7)将AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx1四个基因沉默后采用qRT-PCR方法检测其他抗氧化相关基因表达情况，研究发现，AccCAT、AccGSTS4、AccMsrA等基因的表达水平升高，说明它们可能参与到弥补以上被干扰基因的功能，从而说明AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx1基因在中华蜜蜂抵抗外界不良环境压力过程中发挥重要作用。