Botryosphaeria dothidea和Valsa mali var.mali遗传转化体系的建立

摘要

Botryosphaeria dothidea是林果树木溃疡类病害的重要病原，研究该病菌的侵染和致病过程可有助于揭示病原与寄主的互作机制。携带gfp基因并高效表达的病菌可有效的实时检测和分析病菌的侵染过程，分离定位致病基因可为研究病菌的致病机制提供理论依据。农杆菌介导技术作为一种高效的转化方法，已经广泛的用于多种真菌的遗传转化，携带外源基因的T-DNA可用于基因修饰和构建随机插入突变体库，进而为研究病菌的致病机制鉴定基础。由于B.dothidea在致病和室内培养过程中均不易产孢，因此，制备高质量的原生质体是该病菌进行gfp基因转化和构建突变体库的首要步骤。本研究通过对酶的种类，酶解液浓度，菌丝年龄，酶解时间，酶解温度和渗透压稳定剂6个可能影响B.dothidea原生质体制备效率的参数进行了分析，结果显示原生质体最大产量产生的条件是菌龄42小时，以1.5％崩溃酶、1.5％葡聚糖酶，在0.7 MNaCl的渗透压稳定剂中酶解3.5小时，最适酶解温度31℃，制备的原生质体在酵母蛋白胨蔗糖培养基(YPS)上再生率最高可达48.33％。
　　本研究使用了一个含有潮霉素B磷酸转移酶基因的双元载体pBHt2和我们构建的一个含有潮霉素B磷酸转移酶基因和绿色荧光蛋白基因的双元载体pKO1-HPH，进行农杆菌介导转化B.dothidea原生质体。转化效率为每105原生质体22个转化子，通过PCR检测、转化子稳定性分析和荧光显微观察，分别实现了两者T-DNA在B.dothidea转化子内的稳定遗传和gfp基因的高效表达，Southern杂交显示转化子拷贝数为一个或者两个。
　　Valsa mali var.mali是苹果树等蔷薇科植物腐烂病的病原，目前对于该病菌的控制缺乏行之有效的方法，研究该病菌的侵染和致病过程有助于揭示该病原与寄主的互作机制及致病机制。本研究通过对影响农杆菌介导V.mali var.mali转化过程中的乙酰丁香酮的有无、孢子浓度、共培养时间、共培养温度条件进行了优化探索，建立了一套高效的农杆菌介导V.mali var.mali转化pKO1-HPH，pBHt2的方法，100μl（浓度为1×106个/m1）的孢子液混合100μl经AS诱导的农杆菌，22℃共培养48小时，获得75个转化子。PCR验证了T-DNA成功插入到了病菌的基因组中，转化子的稳定性测定显示插入的T-DNA可以稳定遗传，且gpf能够高效表达，Southern杂交显示转化子中T-DNA均为单拷贝插入。
　　本研究首次建立了B.dothidea的原生质体的高效制备方法，同时首次建立了B.dothidea及优化了V.mali var.mali的遗传转化体系，成功获得GFP高效表达的转化子及大量随机插入的T-DNA转化子。为此后开展这两种丝状真菌的侵染，定殖以及其致病基因分离和功能鉴定及病菌的功能基因组学研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 Botryosphaeria dothidea和Valsa mali var．mali的研究进展

1．1．1 B．dothidea的研究进展

1．1．2 V．mali var．mali的研究进展

1．2 丝状真菌的遗传转化

1．2．1 研究概况

1．2．2 选择性标记

1．2．3 遗传转化方法

1．3 根癌农杆菌介导转化的研究进展

1．3．1 根癌农杆菌的作用机制

1．3．2 根癌农杆菌介导在丝状真菌上的研究现状

1．3．3 根癌农杆菌介导转化的一般方法

1．3．4 根癌农杆菌介导的丝状真菌转化的特点

1．4 本研究的目的意义和技术路线

2 材料与方法

2．1 供试菌株及培养条件

2．1．1 真菌菌株及培养条件

2．1．2 细菌菌株及培养条件

2．2 培养基

2．3 常规分子生物学实验技术

2．3．1 PCR反应

2．3．2 DNA琼脂凝胶电泳

2．3．3 酶切反应

2．3．4 DNA片段的凝胶回收

2．3．5 质粒DNA的提取

2．3．6 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．3．7 大肠杆菌的转化

2．3．8 农杆菌的冻融转化

2．4 B．dothidea菌株原生质体的制备与再生条件优化

2．4．1 B．dothidea菌丝的准备

2．4．2 酶解液的准备

2．4．3 B．dothidea原生质体的制备

2．4．4 B．dothidea原生质体的再生

2．5 载体构建

2．5．1 pKO1-HPH构建

2．5．2 农杆菌的冻融转化

2．6 B．dothidea与V．mall var．mali菌株的T-DNA转化

2．6．1 B．dothidea和V．mali var．mali菌株对潮霉素B的敏感性测定

2．6．2 B．dothidea菌株的T-DNA转化

2．6．3 V．mali var．mali菌株的T-DNA转化

2．7 转化子稳定性及DNA提取与分析

2．7．1 转化子的稳定性分析

2．7．2 CTAB法提取基因组DNA

2．7．3 PCR验证

2．7．4 Southern杂交

2．8 转化子的荧光检测

3 结果与分析

3．1 B．dothidea原生质体制备条件的优化

3．1．1 酶及酶组合对原生质体产量的影响

3．1．2 酶浓度对原生质体产量的影响

3．1．3 菌丝年龄对原生质体产量的影响

3．1．4 酶解时间对原生质体产量的影响

3．1．5 酶解温度对原生质体产量的影响

3．1．6 渗透压稳定剂对原生质体产量的影响

3．2 B．dothidea原生质体的再生

3．2．1 不同再生培养基对原生质体再生的影响

3．2．2 不同酶解时间对原生质体再生的影响

3．3 双元载体构建

3．4 B．dothidea菌株的T-DNA转化

3．4．1 B．dothidea菌株对潮霉素B的敏感性

3．4．2 诱导培养

3．4．3 B．dothidea农杆菌介导转化效率

3．4．4 B．dothidea转化子遗传稳定性分析

3．4．5 B．dothidea转化子的PCR分析

3．4．6 B．dothidea转化子的Southern杂交

3．4．7 B．dothidea转化子荧光检测

3．5 V．mali var．mali菌株的T-DNA转化

3．5．1 V．mali var．mali菌株对潮霉素B的敏感性

3．5．2 V．mali var．mali的T-DNA转化条件的优化

3．5．3 V．mali var．mali转化子遗传稳定性分析

3．5．4 V．mali var．mali转化子的PCR分析

3．5．6 V．mali var．mali转化子的Southern杂交

3．5．7 V．mali var．mali转化子荧光检测

4 讨论

4．1 B．dothidea原生质体的制备

4．2 农杆菌介导的B．dothidea原生质的转化

4．3 农杆菌介导的Valsa mali var．mali的转化

5 结论

5．1 B．dothidea原生质体最优的制备与再生条件

5．2 农杆菌介导B．dothidea转化体系

5．3 农杆菌介导的Valsa mali var．mali的转化体系

参考文献

致谢