小麦近等基因系白粉病抗性反应的转录组分析

摘要

小麦白粉病是由禾本科布氏白粉菌小麦专化型Blumeria graminis f.sp.tritici(Bgt)引起的气传性病害。在我国，自从上世纪80年代以来两次白粉病大流行后，小麦白粉病的发病面积与发病程度均维持在一个较高水平，严重影响我国小麦的籽粒品质与产量，已成为我国小麦高产、稳产、高效、优质的主要制约因素之一。由于在较短时间内小麦白粉病菌就能突变成新的生理小种并且含单一抗性基因品种会在短期内抗性减弱甚至丧失，因此了解小麦在感染病菌后的信号传导及响应对于科学家揭露抗病分子机制以及作物育种有巨大的帮助。
　　本研究以高感白粉病菌生理小种E09小麦品种Chancellor及其近等基因系(NIL)L031（高抗）与两者杂交后代F1（高抗）为研究对象，采用RNA-seq技术对小麦白粉病菌E09分别诱导16h和96h后的Chancellor、L031与F1幼苗进行转录组分析，通过差异表达基因的筛选与注释，从转录组水平上分析抗感病小麦材料对白粉病菌不同的防御反应以及早期病程相关基因的表达。主要结果如下:
　　(1) RNA-seq转录组测序与从头组装及注释
　　对白粉菌侵染16h和96h后三个小麦材料L031，F1以及Chancellor各自的混合样品进行转录组测序，得到六个转录组，包括T1，T2和T3(分别代表L031-16h，F1-16h以及Chancellor-16h);以及T4，T5和T6(分别代表L031-96h，F1-96h以及Chancellor-96h)。六个转录组原始数据经过过滤后各得到4G左右的clean data，Q30％均大于91％。采用Trinity软件对clean data进行从头组装，得到316，787个转录本以及112，033功能基因，其中有63，210个功能基因可被注释。将clean data与指定的参考基因组进行序列比对，各样品测序数据与所选参考基因组的序列比对效率从79.68％到83.01％不等。
　　(2)白粉菌诱导的差异表达基因
　　以基因表达水平差异超过2倍、检验P-value值＜0.005且FDR（错误发生率）≤0.01作为差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）筛选的标准。无参考基因组时在16h处理下，L031与chancellor共有2，932个基因存在表达差异，F1和Chancellor存在1，419个差异表达基因;在96h处理时，L031与Chancellor共有4，697个差异表达基因，F1和Chancellor存在4，583个差异表达基因，后期有更多下游基因表达被引发;有参考基因组时，在16h处理下，T1比T3共有5，052个基因存在表达差异，F1和Chancellor存在1，832个差异表达基因;在96h处理时，L031与chancellor共有4，710个差异表达基因，F1和Chancellor存在4，507个差异表达基因。F1与Chancellor的差异表达基因数目小于L031与Chancellor的差异表达基因，说明在试验设计中添加F1可减少假阳性差异表达基因数目，更加准确识别抗性反应中的重要基因。结果显示侵染后期有更多的下游基因被激发，证实了早期侵染是研究小麦在病菌侵染后对生理小种特异的抗性基因表达与响应的关键时期。本研究对比了在16h和96h侵染条件下L031、F1、Chancellor的共调控基因，在无参和有参两种条件下均发现T1比T3与T2比T3共有的重叠基因主要参与翻译，转录，复制，信号传导等过程;T4比T6与T5比T6共有的重叠基因，与翻译，转录后修饰，能量产生与转化，氨基酸代谢等过程有关，这些重叠的DEGs可能是抗病防御机制中必不可少的基因。
　　(3)不同侵染时间基因表达差异
　　在不同处理时间三种基因型内比对发现，无参考基因组时T1与T4有2，699个差异表达基因，T2与T5有1，952个差异表达基因，T3与T6有4，697个差异表达基因。96h处理下与植物次生代谢通路有关的基因富集。有参考基因组时T1与T4有1，958个差异表达基因，T2与T5有3，456个差异表达基因，T3与T6有1，499个差异表达基因。差异表达基因的KEGG富集分析结果发现许多通路是侵染后期特有的，包括一些次生代谢途径，如生物碱合成，类固醇生物合成，ABC转运子等。
　　(4)涉及抗白粉病反应的抗病基因
　　选取两个时间点在感病材料中表达水平为0或接近与0，而抗病材料L031以及F1表达量极高的差异表达基因发现，许多差异表达基因是抗性相关基因。本研究中设置无参考基因组时，共发现8个编码LRR家族的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的功能基因在抗病材料中均表达上调，其中5个功能基因在感病材料中表达极低，这5个基因可能参与基因介导的抗性，与识别侵染激活下游信号级联反应有关。另外，47个重叠基因在两个处理的抗感病材料差异表达基因中发现，主要编码抗病蛋白RGA，RPM以及RPP，受体类似物蛋白激酶，以及一些假设蛋白。在与参考基因组比对后，共得到76个具有相同表达模式的共调控新基因，注释结果发现其中有19个共调控抗病相关新基因，基因功能主要涉及抗病蛋白RPP、RGA、RPM，LRR受体类似丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶FLS2，WRKY转录因子，半胱氨酸受体类蛋白激酶，脯氨酸富集受体类似蛋白激酶，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体等方面。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 小麦白粉病抗性研究进展

1．2 转录组测序技术RNA-seq

1．3 RNA-Seq技术在植物抗病研究中的应用

1．4 本研究目的与意义

2 试验材料与方法

2．1 试验材料

2．2 菌株

2．3 生化试剂

2．4 主要溶液配方

2．5 主要仪器

2．6 方法

2．6．1 小麦材料的准备

2．6．2 总RNA的提取

2．6．3 高通量测序分析

3 结果与分析

3．1 种质系L031抗白粉病基因的推导

3．2 RNA浓度与纯度的检测

3．3 转录组数据处理

3．3．1 转录组文库质量分析

3．3．2 从头组装及注释

3．3．3 与参考基因组比对

3．4 无参考基因组的转录组分析结果

3．4．1 差异表达基因结果

3．4．2 共调控抗病基因的挖掘

3．4．3 共调控抗病基因的功能注释

3．4．4 早期及晚期抗病基因的挖掘与功能分析

3．4．5 抗病基因的挖掘与分析

3．5 有参考基因组的结果分析

3．5．1 差异表达基因结果

3．5．2 共调控抗病基因的挖掘及功能分析

3．5．3 新基因的挖掘与分析

3．5．4 早期及晚期抗病基因的挖掘与功能分析

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表论文