泰山松花粉多糖对羊绿脓杆菌灭活疫苗的免疫增强作用

摘要

随着我国经济的发展和人民生活水平的提高，人们对羊肉需求量的不断扩大，推动了我国养羊业向规模化和集约化方向发展。然而随着养羊产业的扩大，羊发生传染病的种类也不断地增加。其中呼吸道疾病给羊群的健康带来很大的威胁，绿脓杆菌作为一种条件性致病菌，感染羊群后发生慢性化脓性肺炎，造成羊群呼吸困难、咳嗽、流脓性鼻液等，严重的可以导致羊只死亡，给养羊业带来很大的经济损失。同时绿脓杆菌病作为一种人畜共患病对人类的健康也带来很大的威胁。由此可见，对绿脓杆菌的防治显得尤为重要。
　　目前检测绿脓杆菌多采用传统的细菌分离鉴定方法，主要包括细菌的分离培养、生化鉴定、药敏试验、致病性试验等。随着分子生物学检测技术的发展与应用，绿脓杆菌的PCR检测方法也被广泛地应用。综合这些方法可以准确的对该菌进行鉴定。养殖场中对绿脓杆菌病的防控多采用加入白油等传统佐剂制备的灭活疫苗，但是此类疫苗存在局部产生非细菌性炎症、肉芽肿及降低生产性能等副作用。疫苗中是否可以加入更加安全、高效、绿色的佐剂成为本研究的主要方面。本实验室前期已经证明松花粉多糖作为免疫佐剂可以增强动物机体的免疫功能。因此，本课题从发病羊场分离羊绿脓杆菌，并且制备得到了加入泰山松花粉多糖的羊绿脓杆菌灭活疫苗，研究松花粉多糖对其灭活疫苗的免疫增强作用，以其为泰山松花粉作为羊绿脓杆菌灭活疫苗的佐剂提供技术支持和理论依据。
　　本研究分为两部分:
　　1.羊绿脓杆菌的分离与鉴定
　　对山东省6个地区10个规模化羊场送检的病、死羊进行临床症状观察、病理学检查，对所分离的菌株进行常规细菌学形态检测和16S rRNA基因的分子鉴定。试验结果显示，从剖检病死羊的脏器组织中分离出6株细菌(分别命名为PA1-PA6)，分离菌株在普通营养琼脂上长出淡绿色的菌落，血平板上出现溶血环。镜检显示均为革兰氏阴性的短杆菌，药敏试验表明对庆大霉素高度敏感，动物致病性试验显示对小白鼠具有致病性作用。结合流行病学等初步判定，分离得到的菌株为绿脓杆菌。16S rRNA序列分析结果表明，分离的6株菌与NCBI上发表的绿脓杆菌16S rRNA序列的同源性为99.9-100％，与其中登录的YMD-4、B136-33以及LCQ-4序列的绿脓杆菌菌株位于同一分支上，属于一个亚群，进化树显示与从北京地区分离的B136-33菌株进化关系更近，核苷酸序列同源性为100％。该试验为羊场绿脓杆菌病的诊断和治疗提供了依据。
　　2.泰山松花粉多糖对羊绿脓杆菌灭活疫苗免疫增强作用的研究
　　选取从山东省规模化羊场中分离得到具有较强致病性的羊绿脓杆菌PA2株，培养、灭活制备得到羊绿脓杆菌灭活菌液。通过水提醇沉法提取泰山松花粉多糖，在羊绿脓杆菌灭活菌液中加入不同浓度泰山松花粉多糖，制备羊绿脓杆菌泰山松花粉多糖灭活疫苗。免疫健康的Balb/c小鼠来研究泰山松花粉多糖对注射羊绿脓杆菌灭活疫苗小鼠的免疫增强功能。试验结果显示:泰山松花粉多糖组能提高小鼠的抗体水平、T淋巴细胞转化率、外周血CD4+和CD8+的含量及IL-2的水平。其中松花粉多糖（多糖mg/体重g）在0.4mg/g时免疫效果最佳。在0.2mg/g和0.8mg/g时与0.2mg/g的蜂胶佐剂组免疫效果相当，其免疫效果明显优于无泰山松花粉多糖的羊绿脓杆菌疫苗组，这为开发泰山松花粉多糖羊绿脓杆菌灭活疫苗提供了理论依据。

目录

论文说明

声明

符号说明

摘要

1 引言

1．1 绿脓杆菌病的研究进展

1．1．1 流行病学

1．1．2 发病机理

1．1．3 临床症状

1．1．4 病理变化

1．1．5 诊断

1．1．6 防治方法

1．2 细菌疫苗发展现状

1．3 疫苗灭活剂

1．4 疫苗佐剂研究现状

1．4．1 铝佐剂

1．4．2 油乳佐剂

1．4．3 微生物来源佐剂

1．4．4 天然来源佐剂

1．4．5 中药免疫增强剂

1．4．6 多糖佐剂

1．4．7 松花粉多糖的研究进展

1．5 本研究的内容、目的及意义

2 材料与方法

2．1 羊绿脓杆菌的分离与鉴定

2．1．1 主要试剂

2．1．2 仪器

2．1．3 流行病学调查

2．1．4 细菌的分离培养、纯化及镜检

2．1．5 生化鉴定

2．1．6 药敏试验

2．1．7 致病性试验

2．1．8 分子生物学检测

2．2 泰山松花粉多糖对羊绿脓杆菌灭活疫苗免疫增强作用的研究

2．2．1 试验材料

2．2．2 实验动物

2．2．3 泰山松花粉多糖的制备

2．2．4 疫苗制备

2．2．5 免疫程序

2．2．6 松花粉多糖对小鼠体液免疫的影响

2．2．7 松花粉多糖对小鼠细胞免疫的影响

2．2．8 动物保护试验

3 结果与分析

3．1 绿脓杆菌的分离与鉴定

3．1．1 流行病学调查及病理剖检变化

3．1．2 分离培养结果及细菌形态观察

3．1．3 生化鉴定结果

3．1．4 药敏试验

3．1．5 致病性试验

3．1．6 分子生物学检测

3．2 泰山松花粉多糖对羊绿脓杆菌灭活苗免疫增强作用的研究

3．2．1 小鼠血清中抗体效价的变化

3．2．2 小鼠血清IL-2含量的变化

3．2．3 小鼠T淋巴细胞转化率的变化

3．2．4 小鼠外周血CD4+T淋巴细胞数量变化结果

3．2．5 小鼠外周血CD8+T淋巴细胞数量变化结果

3．2．6 动物保护试验结果

4 讨论

4．1 绿脓杆菌的分离与鉴定

4．2 泰山松花粉多糖对绿脓杆菌灭活疫苗免疫增强作用的研究

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文

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