双酰胺类杀虫剂抗性与敏感品系小菜蛾差异性cDNA及鱼尼丁受体基因分析

摘要

小菜蛾(Plutella xylostellaL.)属鳞翅目菜蛾科，是世界性十字花科蔬菜的重要害虫之一，由于其繁殖力较强，世代重叠严重，加上一些地区生产上用药频繁，导致小菜蛾目前对多种杀虫剂产生了抗药性，这也为该虫的防治造成了较大困难。双酰胺类杀虫剂是一种鱼尼丁受体(RyR)激活剂，它通过持续激活鱼尼丁受体敏感细胞内钙离子的释放来达到杀虫效果，随着双酰胺类杀虫剂的应用，害虫对该药剂的抗性问题也日益受到关注。为了研究小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性机制，本文通过改进的cDNA代表性差异分析(cDNA Representational Difference Analysis，cDNA RDA)法，利用敏感品系cDNA作为“驱赶”来源，小菜蛾氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺抗性品系cDNA作为“检测”来源，筛选出了小菜蛾抗性品系和敏感品系之间的差异性片段;同时以相对敏感品系、氟虫双酰胺抗性品系和田间抗性种群小菜蛾为材料，研究了鱼尼丁受体的基因突变位点及RyR mRNA的相对表达量，旨在为该药剂的科学使用提供指导。主要研究结果如下:
　　1.在前期抗性筛选的基础上，对氯虫苯甲酰胺抗性小菜蛾筛选至30代，其LD50为384.68μg/g，抗性倍数为442.16，自L-F19到L-F26抗性发展速度较快，L-F26之后抗性发展速度相对缓慢;对氟虫双酰胺抗性小菜蛾筛选至21代，LD50为165.98μg/g，抗性倍数为180.22。
　　2.采用cDNA RDA法，从小菜蛾氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺抗性品系中均得到两条与28S rRNA有较高同源性的序列，其中一条序列与编码棉铃虫色素细胞P450类TBP蛋白基因同源性为97％，另一条与编码赤拟谷盗的假定蛋白(Hypothetical Protein)TcasGA2_TC010626基因同源性为93％，同时还得到了两个未知序列。
　　3.克隆了相对敏感品系、氟虫双酰胺抗性品系(F-F20)、BY和ZC种群小菜蛾鱼尼丁受体(PxRyR)C末端大约1690bp的片段，该片段包含已经公布的与小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺有关的突变位点(G4946E)，通过序列比对结果表明:在两个田间ZC和BY种群中，部分个体的突变位点E（谷氨酸）已再次突变为V（缬氨酸）。
　　4.通过实时荧光定量PCR测定，田间抗性种群(ZC、BY)小菜蛾在无任何农药暴露的情况下，鱼尼丁受体mRNA的表达量变化相对稳定，但在检测期间内其LD50逐渐降低，即其抗性倍数逐渐降低。室内抗性品系小菜蛾随诱导抗性倍数的增加，鱼尼丁受体的表达量上调，最高表达量为敏感品系的4.28倍，在药剂停止筛选后抗性倍数逐渐降低，其受体mRNA表达量也随之下调，最低表达量为敏感品系的0.95倍。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 双酰胺类杀虫剂的研究概况

1．1．1 氯虫苯甲酰胺概述

1．1．2 氟虫双酰胺的概述

1．2 小菜蛾抗双酰胺类杀虫剂的研究进展

1．2．1 小菜蛾的发生及危害

1．2．2 小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗药性研究现状

1．2．3 小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗药性机制研究现状

1．3 昆虫抗药性基因表达差异分析方法

1．3．1 cDNA代表性差异分析(cDNA RDA)

1．3．2 mRNA显示技术(DDRT)

1．3．3 基因表达系统分析(SAGE)

1．3．4 抑制性消减杂交(SSH)

1．3．5 cDNA微阵列(cDNA Microarray)

1．3．6 双向电泳技术(Two-dimensional gel electrophoresis)

1．3．7 高通量测序技术

1．3．8 几种差异表达分析方法的比较

1．4 选题目的和意义

1．5 本研究的技术路线

2 材料与方法

2．1 供试药剂、试剂和主要仪器

2．1．1 供试药剂与化学试剂

2．1．2 主要分子试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 供试昆虫与饲养

2．2．1 供试昆虫

2．2．2 试剂及培养基的配制

2．3 毒力测定及抗性选育

2．4 分子试验方法

2．4．1 小菜蛾抗性品系与敏感品系的cDNA代表性差异分析

2．4．2 小菜蛾基因突变的检测

2．4．3 不同品系小菜蛾对RyR的表达量

2．5 数据处理与分析

3 结果与分析

3．1 氯虫苯甲酰胺对三种小菜蛾品系／种群的毒力测定

3．2 氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺对小菜蛾抗性选育

3．3 小菜蛾cDNA代表性差异分析

3．3．1 RNA的提取和cDNA的合成

3．3．2 eDNA RDA差异片段的获得

3．3．3 差异性片段的测序结果

3．3．4 差异性片段的核酸及蛋白质的比对结果

3．4 小菜蛾鱼尼丁受体(PxRyR)C末端突变位点的克隆及检测

3．4．1 基因克隆与序列比对

3．5 RyR在不同品系／种群小菜蛾中的表达量

3．5．1 扩增效率

3．5．2 不同品系小菜蛾RyR基因的表达量

4 讨论

4．1 cDNA RDA在获得小菜蛾差异性基因中的应用

4．2 细胞色素P450基因的分析

4．3 鱼尼丁受体基因突变频率检测

4．4 不同品系RyR基因表达量的检测

4．5 有待继续研究的问题

5 结论

5．1 小菜蛾对氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺抗性发展

5．2 cDNA代表性差异分析

5．3 RyR的基因突变检测

5．4 不同品系RyR的基因表达量变化

本文创新之处

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况