甜樱桃果实花青苷形成的生理生化与转录组分析

摘要

本文以甜樱桃深红色品种‘美早’和纯黄色品种‘13-33’果实为试材，对果实发育期间花青苷、可溶性糖和有机酸组分、含量及相关酶活性变化进行了研究;采用转录组和数字基因表达谱技术比较分析了两品种不同发育阶段基因表达的差异，挖掘与花青苷合成相关的结构基因和转录因子;并对花青苷生物合成相关转录因子进行了克隆和表达分析。主要研究结果如下:
　　1.测定了‘美早’和‘13-33’果实发育期间花青苷含量及PAL、CHI、DFR和UFGT酶活性。结果发现，‘美早’中花青苷含量随着果实的发育逐渐升高，特别是在转色期后急剧升高;花青苷含量与PAL和DFR酶活性关系不密切，而与CHI和UFGT酶活性密切相关。‘13-33’的花青苷含量随着果实的发育变化不明显，并且一直维持在极低水平。
　　2.通过对提取溶剂、净化条件、色谱和质谱参数等的优化，建立了甜樱桃花青苷类物质超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)定性定量检测方法。采用该方法对‘美早’和‘13-33’果实中花青苷类物质进行定性和定量测定。结果表明:从‘美早’果实中检测出7种花青苷，各组分含量伴随着果实的发育逐渐升高。从‘13-33’中仅检测出4种花青苷，各组分含量在果实发育期间逐渐降低，到果实成熟期其含量已甚微。其中，矢车菊素-3-木糖苷和飞燕草素-3-葡萄糖苷在甜樱桃中属首次发现。
　　3.利用HPLC方法测定了不同色泽甜樱桃果实发育过程中可溶性糖和有机酸组分及含量。研究发现，从‘美早’和‘13-33’中均检测出葡萄糖、果糖和山梨醇，各组分和总糖的含量均随果实的发育逐渐升高。‘美早’果实花青苷含量与果糖、葡萄糖和山梨醇均呈显著正相关。两品种中有机酸的种类没有差异，但是各有机酸和总酸含量在两品种果实发育期间的变化趋势不同。在整个果实发育期间苹果酸的含量最高，是决定甜樱桃品种酸度的主要因素。
　　4.利用Illumina/Solexa测序平台对‘美早’和‘13-33’果实进行转录组测序。测序获得66，392，570高质量reads，通过De novo混合拼接共获得43，128条unigenes。基因功能注释结果发现，共计22，452条unigenes(46.59％)得到了功能注释，其中，20，095条unigenes被注释到Nr数据库。根据Nr数据库的注释信息，共有16，853条unigenes映射到GO不同的节点。在KOG分类中，8，645条unigenes被分配到26个类别。通过 KEGG代谢通路分析发现，4，035条unigenes参与了242个生物学途径，其中72条unigenes被注释到花青苷生物合成途径。
　　5.对‘美早’和‘13-33’花后20d、35d、45d和55d的果实进行了数字基因表达谱(DGE)分析，分别得到了大于700万的Clean reads。利用表达谱对甜樱桃花青苷生物合成途径相关基因的表达进行分析，结果表明，在‘美早’果实发育过程中，PAL、4CL、CHS、CHI、F3H、 F3'H、 DFR和UFGT基因呈上调表达模式。与此相反，‘13-33'中这些基因的表达量总体呈逐渐降低的趋势。这基因的表达与两品种花青苷的积累规律一致。此外，筛选出4个MYB、2个bHLH和1个WD40转录因子候选基因可能调控花青苷生物合成。采用qRT-PCR对这18个与花青苷生物合成相关的基因进行了表达验证，结果表明qRT-PCR与表达谱分析结果基本一致。
　　6.利用RT-PCR技术从‘美早’果实中克隆了花青苷生物合成相关转录因子基因的cDNA全长。包括3个MYB基因，分别命名为PaMYB10、PaMYB111和PaMYB11，均属于R2R3MYB类群;2个bHLH基因，分别命名为PabHLH3和PabHLH13;1个WD40基因，命名为PaWD40。序列对比和系统进化树分析表明，6个转录因子基因与其它植物来源的相应基因同源性较高。PaMYB10、PaMYB111、PaMYB11、PabHLH3、PabHLH13和PaWD40在茎、幼叶、花和果实中均有表达，在富含花青苷的幼叶和成熟果实中表达量较高。

目录

声明

缩略语表

摘要

1 前言

1．1 花青苷的结构和基本性质

1．2 花青苷在植物体中的作用及其生物活性

1．2．1 花青苷在植物体中的作用

1．2．2 花青苷的生物活性

1．3 花青苷的提取、纯化和定性、定量分析

1．3．1 花青苷的提、纯化

1．3．2 花青苷的定性定量分析

1．4 花青苷的生物合成及其调控机制

1．4．1 花青苷生物合成途径及其关键酶

1．4．2 关键结构基因的表达调控

1．4．3 花青苷生物合成的转录调控

1．4．4 园艺植物花青苷合成的转录调控

1．4．5 花青苷生物合成的其它影响因素

1．5 转录组测序(RNA-Seq)技术及其在果树生物学研究中的应用

1．5．1 转录组及RNA-Seq概述

1．5．2 RNA-Seq在果树上的应用

1．6 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料及样品采集

2．1．2 菌株和载体

2．1．3 主要药品、试剂盒和仪器

2．1．4 PCR引物

2．2 试验方法

2．2．1 叶绿素与类胡萝素含量的测定

2．2．2 PAL和CHI酶活性测定

2．2．3 DFR和UFGT酶活性测定

2．2．4 果实中花青苷的提取、纯化、含量和组分测定

2．2．5 可溶性糖和有机酸的HPLC分析

2．2．6 总RNA的提取和检测

2．2．7 甜樱桃果实转录组文库构建及高通量测序

2．2．8 转录组的生物信息学分析

2．2．9 数字基因表达谱分析

2．2．10 qRT-PCR分析

2．2．11 目的基因克隆

2．2．12 序列分析和同源性比较

3 结果与分析

3．1 不同色泽甜樱桃果实发育期间叶绿素、花青苷及相关酶活性变化

3．1．1 叶绿素与类胡萝l、素含量变化

3．1．2 花青苷含量变化

3．1．3 PAL、CHI、DFR和UFGT酶活性变化

3．1．4 花青苷含量与PAL、CHI、DFR和UFGT酶活性的相关性分析

3．2 不同色泽甜樱桃果实发育期间花青苷、可溶性糖、有机酸组分和含量变化

3．2．1 甜樱桃花青苷类物质UPLC／MS／MS定性定量检测方法的建立

3．2．2 不同色泽甜樱桃果实发育期间花青苷组分及含量测定

3．2．3 不同色泽甜樱桃果实发育期间可溶性糖组份及含量测定

3．2．4 不同色泽甜樱桃果实发育期间有机酸组分及含量的测定

3．3 甜樱桃果实转录组测序及生物信息学分析

3．3．1 RNA提取及质量评价

3．3．2 转录组测序及De novo组装

3．3．3 Unigene的功能注释和分类

3．4 数字基因表达谱分析及花青苷生物合成途径相关基因筛选

3．4．1 数字基因表达谱测序及注释

3．4．2 差异基因表达分析

3．4．3 与花青苷生物合成相关的差异表达基因筛选

3．4．4 差异表达基因的qRT-PCR验证

3．5 花青苷合成转录因子基因的克隆和表达分析

3．5．1 花青苷合成相关MYB、bHLH和WD40转录因子基因的克隆和序列分析

3．5．2 氨基酸序列的同源性和系统进化分析

3．5．3 花青苷合成相关转录因子基因在不同组织中的表达分析

4 讨论

4．1 甜樱桃果实发育期间花青苷积累与PAL、CHI、DFR和UFGT酶活性之间的关系

4．2 甜樱桃果实发育期间花青苷组分、可溶性糖和有机酸代谢及其之间的关系

4．3 甜樱桃果实转录组和表达谱测序及花青苷合成相关结构基因的筛选

4．4 甜樱桃花青苷合成相关转录因子的筛选、克隆及表达

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的论文