表达空肠弯曲菌保护性抗原cfrA、cjaA基因的重组乳酸菌的构建及口服免疫研究

摘要

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是弯曲菌属的一种微需氧革兰氏阴性菌，可在宿主肠道中定殖和感染引起多种疾病，如感染人引起肠炎和腹泻，是人最重要的食源性病原菌之一。控制家禽弯曲菌的污染是降低人感染该菌最直接有效的手段，本研究拟结合特异性与非特异性免疫，将空肠弯曲菌保护性抗原基因导入食品级乳酸菌表达系统，构建表达保护性抗原的重组乳酸菌口服免疫制剂，达到降低鸡肠道空肠弯曲菌定殖水平的目的。
　　本研究首先将空肠弯曲菌肠菌素受体蛋白CfrA编码基因导入食品级乳酸乳球菌表达系统，将构建的重组乳酸乳球菌口服免疫鸡，达到降低空肠弯曲菌在鸡肠道中定殖的目的。利用PCR分别扩增空肠弯曲菌CfrA全基因及其N端片段，插入食品级表达载体pNZ8149多克隆位点并转化乳酸乳球菌NZ3900，通过Western blot鉴定重组菌株CfrA蛋白表达情况，筛选nisin浓度、温度、时间等诱导条件优化重组蛋白表达水平；将重组乳酸乳球菌经口服免疫 SPF鸡，免疫后分别测定乳酸乳球菌自鸡体内的排出情况、诱导CfrA血清抗体和粘膜抗体水平，最后将空肠弯曲菌口服攻毒免疫后的鸡，测定鸡泄殖腔棉拭子中空肠弯曲菌的数目来判定口服免疫效果。Western blot检测显示CfrA全基因及其N端片段均可在重组乳酸乳球菌胞内可溶性表达，不能分泌至胞外，筛选的最佳诱导表达条件为nisin浓度25 ng/mL、温度37℃、时间1h。口服乳酸乳球菌10d内自鸡体完全排空；鸡口服免疫后可产生CfrA蛋白特异性的血清IgG和肠粘膜sIgA抗体；重组乳酸乳球菌口服免疫后空肠弯曲菌在鸡体内的增殖速度显著低于对照组。本研究成功构建了重组CfrA蛋白的食品级乳酸乳球菌诱导表达系统；表达CfrA蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫鸡对空肠弯曲菌在鸡肠道的定殖具有一定的抑制作用。在空肠弯曲菌CfrA蛋白重组表达的基础上，构建CjaA及CjaA-LTB蛋白重组乳酸乳球菌分泌性表达系统。利用PCR扩增乳酸乳球菌-MG1363-未知分泌蛋白Usp45基因分泌信号肽的编码序列 SPusp45，克隆到食品级载体 pNZ8149中，以空肠弯曲菌主要免疫保护性抗原CjaA蛋白的基因片段为靶基因，并插入大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因(LTB)，构建了表达空肠弯曲菌 cjaA基因和融合表达 cjaA-LTB的重组分泌性乳酸乳球菌表达系统，并对免疫效果进行比较分析，Western blot检测显示cjaA基因可在重组乳酸乳球菌胞内可溶性表达，口服乳酸乳球菌7d内自鸡体慢慢排空；鸡口服免疫后可产生 CjaA蛋白特异性的血清 IgG和肠粘膜 sIgA抗体；重组乳酸乳球菌口服免疫后空肠弯曲菌在鸡体内的增殖速度显著低于对照组。结果成功构建了重组CjaA蛋白的食品级分泌性乳酸乳球菌诱导表达系统；表达 CjaA蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫鸡对空肠弯曲菌在鸡肠道的定殖具有一定的抑制作用。

目录

封面

声明

符号说明

目录

中文摘要

英文摘要

1.引言

1.1空肠弯曲菌研究现状

1.2乳酸菌及其表达系统的研究现状

1.3黏膜免疫的研究进展

1.4本研究的目的与意义

2.材料与方法

2.1 材料

2.2胞内表达空肠弯曲菌cfrA基因重组乳酸乳球菌的构建

2.3 cfrA基因在重组乳酸乳球菌中的表达及表达条件的优化

2.4表达CfrA蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫研究

2.5表达空肠弯曲菌cjaA基因大肠杆菌重组表达载体的构建

2.6 cjaA基因在重组大肠杆菌中的表达与纯化

2.7分泌表达空肠弯曲菌cjaA与cjaA-ltb基因的重组乳酸乳球菌的构建

2.8 cjaA与cjaA-ltb基因在重组分泌性乳酸乳球菌中的表达

2.9 表达CjaA蛋白和融合表达CjaA与LTB重组分泌性乳酸乳球菌口服免疫研究

3.结果与分析

3.1胞内表达空肠弯曲菌cfrA基因重组乳酸乳球菌的构建

3.2 cfrA基因在重组乳酸乳球菌中的表达及表达条件的优化

3.3表达CfrA蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫研究

3.4表达空肠弯曲菌cjaA基因大肠杆菌重组表达载体的构建

3.5 cjaA基因在重组大肠杆菌中的表达与纯化

3.6分泌表达空肠弯曲菌cjaA与cjaA-ltb基因重组乳酸乳球菌的构建

3.7 cjaA与cjaA-ltb基因在重组分泌性乳酸乳球菌中的表达

3.8表达CjaA蛋白的重组分泌性乳酸乳球菌口服免疫研究

4.讨论

5.结论

参考文献

致谢

个人简介

攻读硕士学位期间发表的论文