拉米夫定对禽白血病病毒的体内外抑制效应及其应用

摘要

禽白血病（Avian leukemia，AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的禽类多种良性和恶性肿瘤性疾病，临床上多以免疫抑制、生长抑制和多器官组织出现肿瘤等为主要特征，其传播主要通过垂直传播。此外，由于一些弱毒疫苗中污染了ALV也给规模化养鸡业和家禽疫苗产业带来了巨大的危害。目前尚无有效的商品化疫苗用于ALV的预防。ALV与人获得性免疫缺陷综合症病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）同属于反转录病毒，鉴于通过多种药物及其组合已经较好的控制了HIV，我们有兴趣知道类似的药物是否可以辅助降低外源性ALV的感染率或用于去除疫苗中ALV污染。本研究观察了逆转录酶抑制剂类药物拉米夫定（Lamivudine，LAM）对ALV-J在体外和体内的抑制作用并成功在模拟实验中将新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）弱毒疫苗中ALV-A污染去除。
　　本研究主要内容包括：⑴通过在不同药物浓度培养液中细胞的连续传代和CCK-8细胞毒性测定两种方法确定了在培养液中添加不超5ug/ml的LAM对于DF-1细胞复制没有影响。为了解不同浓度LAM对ALV-J在体外的抑制作用，实验将J亚群rNX0101株接种到DF-1细胞上，然后在不同孔中分别使用20ug/ml，10ug/ml，5ug/ml，1ug/ml LAM的维持液培养以测定病毒复制动态。结果显示，5ug/ml的安全用药范围内，其抗病毒作用与其浓度呈正相关，即随着药物浓度的增加，rNX0101的复制受到抑制作用随之增强。按照类似操作观察了LAM对ALV-A也有明显的抑制作用。将人为污染ALV-A的NDV疫苗毒种经过5 ug/ml的LAM连续干预2代后，经接种SPF鸡、病毒分离以及核酸检测确认成功将其中人为污染的ALV去除。⑵经细胞活性实验和对病毒的抑制作用实验确定5 ug/ml为ALV复制被显著抑制但可以继续复制的药物浓度用于构建药物选择压，在6孔细胞板中分别设置用药组和空白组。连传60代后，将原始毒株、第六十代用药组病毒及第六十代未用药组病毒进行准确定量，以相同病毒量接种细胞，分别观察同等接种剂量在添加0ug/ml和5 ug/ml的LAM后不同毒株复制曲线，结果显示5ug/ml药物浓度下，对原始毒株抑制作用远远高于对药物选择压下的传代毒株，证实出现了对LAM产生耐药性的ALV-J毒株。⑶给不同组别的鸡分别使用不同剂量的LAM后通过定期称重并检测针对NDV和AIV-H9的抗体评估不同剂量LAM对鸡体重和免疫功能的影响，结果显示分别使用1mg，4mg和6mg的药物组其体重以及AIV-H9和NDV抗体与未空白对照组相比差异均不显著。将不同组别的鸡人工攻毒后分别使用不同剂量的药物连续用药一周，从第一周起每只鸡采集抗凝血检测各组病毒血症阳性率。结果显示，未使用LAM的ALV-J感染组在感染后21d时有85.00％转为病毒血症阳性，并且直到105d时还维持在一个较高的病毒血症水平（65.00%），而使用4mgLAM的感染组在63d时即转为病毒血症阴性。使用1mg LAM的用药组尽管没有完全消除ALV-J的感染，但病毒血症阳性率也明显低于未使用药物的感染组。⑷本研究证实了LAM对ALV-J在体内外的抑制作用并成功应用于降低ALV-J感染和去除ALV-A污染，构建了药物选择压下ALV-J的连续传代系列，为进一步研究逆转录病毒耐药性产生的分子机制打下来良好的基础。

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1前 言

1.1禽白血病病毒（ALV）的研究进展

1.2 HIV的研究进展

1.3本试验研究的目的和意义

2材料和方法

2.1材料

2.2 方法

3 结果

3.1 DF-1细胞安全药物浓度确定

3.2 第六十代耐药毒株的验证

3.3 不同 LAM 添加浓度对 ALV-J 体外复制的抑制作用

3.4 不同浓度LAM对海兰褐鸡生长速度的影响

3.5不同浓度LAM对NDV和AIV-H9免疫的抗体反应的影响

3.6 不同剂量LAM对ALV-J在海兰褐鸡体内复制的抑制作用

3.7 应用LAM去除疫苗毒种中ALV-A污染

4 讨论

4.1不同浓度 LAM 对 ALV-J 体外抑制实验

4.2 药物选择压下耐药毒株的产生

4.3 不同剂量 LAM 对 ALV-J 在海兰褐鸡内复制的抑制实验

4.4 人工模拟应用LAM去除疫苗毒种中ALV-A污染实验

5 结论

参考文献

致谢

8硕士期间发表的论文