花生ABA途径抗逆基因AhLOS5克隆与抗逆性研究

摘要

花生（Arachis hypogaea L.）是我国重要的油料作物和经济作物，以其扎根深、开花量大、花期长、无明显的需水临界期以及水分利用率较高等特点，具有较强的抗旱性，是发展旱作农业和旱薄地开发的理想作物。干旱往往伴随土壤荒漠化、盐渍化的加重，给农业生产带来多种因素的制约。在全球范围内，有2/3的花生分布在旱作地区，缺少灌溉条件加之瘠薄的砂质土壤，使干旱和高盐危害非常普遍，已成为花生生产上分布最广、危害程度最大的限制因素。在我国，常年有70％的花生遭受不同程度的干旱和高盐胁迫，干旱和高盐引起的荚果减产率平均在20%以上。
　　植物对非生物逆境的响应伴随着对生长发育过程很多基因的调控。植物激素脱落酸（abscisic acid, ABA）能参与植物对许多环境胁迫如干旱、冷害、盐害等的生理反应和分子生物学效应。目前ABA已经公认为能够诱导植物产生对不良环境的抗性（抗旱性、抗寒性、抗病性、耐盐性等），是植物的“抗逆诱导因子”。目前公认的高等植物体内的ABA的生物合成主要为间接途径，反应过程中的玉米黄质环氧化酶（ZEP）、9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）、ABA醛氧化酶（AAO）及钼辅因子硫化酶（MCSU）是关键调控酶。
　　本研究从花生栽培品种‘丰花1号’中克隆了钼辅因子硫酸化酶基因AhLOS5，进行了抗逆性鉴定和基因功能验证。构建了含AhLOS5基因的正义和反义植物表达载体，农杆菌介导分别转化三生烟草，获得了不同AhLOS5表达水平的转基因烟草植株，并对这些转基因株系的 T1代植株进行了生物学功能分析。通过生理分析、遗传鉴定、分子生物学和生物化学的研究确定AhLOS5应答非生物逆境的机制。具体结果如下：
　　（1）选取了黄淮海花生产区4个主推品种，进行抗旱性鉴定。抗旱性能排名为‘花育20号’>‘丰花1号’>‘海花1号’>‘白沙1016’。
　　（2）在黄淮海花生主产区种植面积较大，同时表现高抗旱性的花生品种‘丰花1号’中成功克隆花生AhLOS5基因。全长2731个碱基，包括2451bp的开放阅读框，115bp的5′非编码区，165bp的3′非编码区，ORF编码816个氨基酸。该基因编码钼辅因子硫酸化酶，属于MOSC超家族。同源性分析证明，我们克隆得到的‘丰花1号’AhLOS5与花生二倍体野生种 A.duranensis中的 AdLOS5同源性最高，达到94.7%，与 AiLOS5同源性为92.2%。与其他高等植物相比，AhLOS5与同属豆科的狭叶羽扇豆、矮沙冬青、木豆、同源性较高，分别为77.7%、73.7%和72.9%，与属十字花科的拟南芥同源性略低，为59.9%。
　　（3）以AhLOS5 cDNA核苷酸片段制备探针对4个主推品种中AhLOS5的表达特性进行了分析。结果显示，AhLOS5在4个主推品种中表达量顺序为‘花育20号’>‘丰花1号’>‘海花1号’>‘白沙1016’。我们发现，4个品种间的AhLOS5基因表达量排序与其抗旱性排序一致。验证了该基因在花生中的抗旱性。
　　（4）采用Northern杂交的方法对‘丰花1号’中AhLOS5的表达特性进行了分析。结果表明，AhLOS5在花生中组成型表达，花生各器官中表达量顺序为花>成熟叶>幼果>果针>根>茎，在叶片中的表达量随着叶龄的增加而增加，在叶片展开第50d达到峰值。AhLOS5的表达还受干旱和盐胁迫诱导，诱导作用明显。
　　（5）构建了2种植物表达载体，即含正义 AhLOS5的载体 pBI-LOS5和含反义AhLOS5的载体pBI-R-LOS5。以三生烟草为转化受体，采用农杆菌介导的方法，将上述2种载体分别转化。转不同载体的转基因烟草当代（T0代）所结的种子，经卡那霉素筛选，并结合转基因株系的T1代植株PCR鉴定结果，初步确定，含反义AhLOS5的转基因植株有20株，含正义AhLOS5的转基因植株有52株，并选取部分不同类型的转基因植株进行了Northern杂交分析。
　　（6）通过转基因烟草植株种子根长、叶绿素含量、相对含水量、相对电导率、丙二醛（MDA）、抗坏血酸（ASA）、抗氧化酶活性（SOD，POD，CAT，APX）、内源ABA、脯氨酸等生理生化指标检测发现，在干旱和盐胁迫下，过表达AhLOS5的转基因烟草转基因植株体内内源ABA含量显著升高，抗氧化酶活性明显升高，膜脂完整性好，渗透调节物质含量高。过表达AhLOS5能够明显的提高转基因株系对干旱和盐胁迫的抗性。
　　（7）用Northern blot方法对转基因烟草中另外3个抗逆相关基因DREB2B，RD22， P5CS表达进行检测。结果显示，在干旱和盐胁迫下，正义转基因和野生型对照植株的3个基因 DREB2B，RD22，P5CS都诱导表达；而反义转基因植株中只有不依赖 ABA的抗逆基因DREB2B诱导表达，依赖ABA的抗逆基因RD22和P5CS都不诱导表达。这证明了AhLOS5参与的植物抗逆途径属于依赖ABA途径，过表达AhLOS5转基因烟草获得的抗逆性是由胁迫诱导产生的内源ABA调控的。

目录

声明

符 号 说 明

1 前言

1.1 花生在国民经济中的地位

1.2 植物的抗逆性

1.3 ABA与逆境胁迫

1.4 ABA相关的抗逆基因工程

1.5 本研究的目的意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 数据统计分析

3 结果与分析

3.1 花生AhLOS5的克隆及序列分析

3.2 花生AhLOS5基因功能分析

3.3 花生AhLOS5转化烟草研究

4 讨论

4.1 ABA与非生物胁迫

4.2 花生AhLOS5基因的克隆与抗性研究

4.3 过表达花生AhLOS5基因提高转基因烟草对干旱和盐胁迫的抗性

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间获得成果情况