CFTR低表达在HHcy致ApoE-/-鼠动脉粥样硬化脂代谢紊乱中的作用机制研究

摘要

目的：
　　本实验拟观察肝脏组织囊性纤维化跨膜转导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）表达改变及其介导的内质网应激（en-doplasmic reticulum stress，ERS）在高同型半胱氨酸血症（hyperhomo cysteinemia，HHcy）致ApoE－/－鼠动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)脂代谢紊乱中的作用及其机制，探讨HHcy致AS的可能作用靶点。
　　方法：
　　选用SPF级近交系C57BL/6J背景的5周龄雄性ApoE－/－小鼠为研究对象，适应环境一周后，将小鼠随机分为4组：正常对照组（n＝6）：选择健康5周龄雄鼠（SPF级C57BL/6J），饲以正常饮食。另选5周龄雄性纯合子 ApoE－/－鼠（SPF级近交系C57BL/6J）18只，随机分为3组，每组6只：ApoE－/－对照组、高蛋氨酸组、干预组，分别给予正常饮食、高蛋氨酸饮食、高蛋氨酸饮食加0.006%叶酸及0.0004%维生素B12。喂养14周后眼球取血，分离血清，用酶联免疫吸附法检测血清同型半胱氨酸水平；主动脉病理切片进行HE染色、肝脏冰冻切片进行油红O染色；全自动生化分析仪检测血清LDL、HDL、TG、CHOL含量；DAPI染色观察肝组织细胞核；透射电镜观察肝组织超微结构；实时定量荧光 PCR检测小鼠肝组织CFTR、葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein78，GRP78）、活化转录因子6（activating transcription factor6，ATF6）、蛋白激酶样内质网激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、X盒结合蛋白-1（X-box binding protein-1，XBP-1）mRNA的表达以及免疫组织化学法检测小鼠肾脏CFTR蛋白的表达；酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测肝组织中caspase-12、Grp78、ATF6、PERK、XBP-1的含量；
　　结果高蛋氨酸组小鼠血清Hcy水平显著增加（P<0.01），干预组血清Hcy水平较高蛋氨酸组降低（P<0.05）；主动脉HE染色结果显示与正常对照组比较，高蛋氨酸组小鼠主动脉管壁可见大量动脉粥样硬化样物质，干预组小鼠主动脉管壁病变较高蛋氨酸组有所缓解。由此表示，小鼠HHcy和动脉粥样硬化双模型建立成功。
　　全自动生化仪结果显示高蛋氨酸组血清LDL、TG、CHOL含量显著增加(P<0.01)、血清HDL含量显著降低（P<0.01），干预组血清LDL、TG、CHOL含量较高蛋氨酸组降低（P<0.05）、血清HDL含量较高蛋氨酸组增加（P<0.05）；肝脏油红O染色结果显示与正常对照组比较，高蛋氨酸组小鼠肝脏可见大量脂滴存在，干预组小鼠肝脏脂滴较高蛋氨酸组减少。
　　4000倍镜下线粒体肿胀或浓缩、嵴断裂或变短、粗面内质网和滑面内质网均大量增生，干预组线粒体略有肿胀，粗面内质网和滑面内质网略有增生。实时定量荧光 PCR结果显示，高蛋氨酸组GRP78、ATF6、PERK、XBP-1 mRNA的表达组显著增加（P<0.01），干预组GRP78、ATF6、PERK、XBP-1 mRNA的表达较高蛋氨酸组显著降低（P<0.01）；ELISA结果表明高蛋氨酸组Grp78、PERK、ATF6、XBP-1含量显著增加（P<0.01），干预组血清Grp78、PERK、ATF6、XBP-1含量较高蛋氨酸组降低（P<0.05）。
　　DAPI染色结果显示高蛋氨酸组可见细胞核增大，细胞核膜与周围边界不清晰，干预组细胞核则大小较均一，核膜光滑。透射电镜结果显示700倍镜下高蛋氨酸组染色质聚集浓缩或边缘化，可见凋亡小体及前体，干预组细胞膜完整，染色质略微聚集凝固未见凋亡小体及前体。ELISA结果显示高蛋氨酸组caspase-12的含量显著增加（P<0.05）干预组caspase-12的含量含量较高蛋氨酸组降低。
　　实时定量荧光PCR结果显示，高蛋氨酸组CFTR mRNA的表达显著降低（P<0.01），干预组CFTR mRNA的表达较高蛋氨酸组显著增加（P<0.01）；小鼠肝组织经免疫组化染色后通过Image Pro Plu6.0软件统计CFTR蛋白阳性染色区域，免疫组织化学法检测CFTR蛋白的表达与其mRNA的表达变化一致；
　　小鼠肝脏CFTR mRNA表达与GRP78、ATF6、PERK、XBP-1 mRNA表达的相关系数分别为：r＝－0.7192，P＜0.01；r＝－0.5501，P＜0.01；r＝－0.7772，P＜0.01；r＝－0.6785，P＜0.01。
　　结论：
　　在HHcy致ApoE－/－鼠动脉粥样硬化的过程中，可能是由于HHcy引起了ApoE－/－鼠肝组织CFTR表达减低进而引起肝组织质网应激源性的细胞凋亡，从而导致了肝脏脂质代谢的异常，促进了AS的发生。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

材料与方法

1.实验仪器和材料

2.实验方法

3. 统计学处理

结果

1.各组小鼠血清同型半胱氨酸水平的变化

2. 各组小鼠主动脉HE染色光学显微镜下组织学观察

3.各组小鼠血清LDL、HDL、TG、CHOL水平的改变

4.各组小鼠肝脏冰冻切片油红O染色光学显微镜下组织学观察

5. DAPI染色观察各组小鼠肝脏组织细胞核形态学改变

6.透射电镜700倍下观察各组小鼠肝组织超微结构

7.各组小鼠肝脏caspase-12的含量测定

8.各组小鼠肝组织CFTR mRNA及蛋白表达

9.透射电镜4000倍下观察各组小鼠肝脏超微结构

10.各组小鼠肝组织GRP78、ATF6、PERK、XBP-1 mRNA的表达

11.各组小鼠肝组织GRP78、ATF6、PERK、XBP-1的含量测定

12.小鼠肝组织CFTR mRNA与GRP78、ATF6、PERK、XBP-1 mRNA的相关性分析

讨论

结论

参考文献

综述:内质网应激与肝细胞凋亡的研究进展

攻读硕士期间发表的学术论文

致谢

个人简历