高温处理后尼罗罗非鱼性逆转雄鱼与未逆转雌鱼的差异性腺转录组研究

摘要

动物性别决定一直以来是生物学领域的研究热点，它对个体的发育和自然种群性别比例组成等都具有深刻的影响。依据性别决定因素，性别决定模式可分为遗传性别决定（Genotypic Sex Determination,GSD）和温度性别决定（Temperature-dependent Sex Determination,TSD）两类。鱼类的性别决定模式介于遗传性别决定（GSD）和温度性别决定（TSD）之间，也称为GSD+TE（Temperature Effect）类型，即在性腺分化期温度变化能部分影响鱼类的性别决定。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是一种性别分化方向受到基因和温度双重影响的鱼类，即在尼罗罗非鱼的性别分化期，温度能够对其性别分化的方向起到一定的导向作用，而温度是如何影响其性别分化，以及尼罗罗非鱼性腺分化早期的高温处理对其性腺发育的影响如何，具体的分子机制是什么，目前还不是很清楚。
　　本研究通过伪雄鱼和野生型雌鱼交配的方式建立3个尼罗罗非鱼全雌家系，三个家系高温处理后的性逆转率分别为90.4％、86%和74%。我们挑取雄性率最高的家系分别利用HE染色和Illumina Hiseq技术对受精后120天全雌家系（对照组）和高温处理组雌雄尼罗罗非鱼性腺进行组织学检测和高通量转录组测序。组织学结果显示高温处理后的雌鱼卵母细胞排列松散，高温处理后的雄鱼性腺和正常野生型雄鱼相似，没有显著变化。将测序所得转录组数据与尼罗罗非鱼基因组进行比对，对照组雌鱼（CF）、高温处理组雌鱼（TF）、高温处理组雄鱼（IM）共获得149624210 Raw Reads，共有124515460 Clean Reads，平均有80.09%Clean Reads比对到尼罗罗非鱼基因组上。CF、TF和IM三组间两两比较，结果显示差异表达基因（DEG）上、下调数目分别为：CF/TF共有DEG79个，其中上调DEG34个，下调DEG45个；CF/IM共有DEG11117个，其中上调DEG5779个，下调DEG5338个；TF/IM共有DEG11000个，其中上调DEG5607个，下调DEG5393个。Venn图显示CF/TF和CF/IM、CF/TF和TF/IM、CF/IM和TF/IM共有的DEG分别为54、44和9451个。将CF/TF DEG按照不同差异倍数进行分析，发现有很多差异倍数大于7的差异基因。另外将所获得的DEG分别通过COG、NR、KEGG、GO和Swiss Prot注释，其中GO分析将DEG分为三类，分别为Cellular Component（CC），Molecular Function（MF）和Biological Process（BP）。另外还在Ovarian steroidogenesis,Cell cycle,GnRH signaling pathway,Natural killer cell-mediated cytotoxicity等生物学通路中鉴定出许多DEG。
　　本研究接着对鉴定出的性类固醇激素合成相关基因和温度响应相关基因，利用qRT-PCR进行验证，共验证了10个基因，发现雄性激素合成相关基因表达上调如hsd17b7、3β-hsd，雌性合成相关基因表达下调如cyp19a1a。并且短暂性腺分化早期的高温处理持续影响了cyp19a1a、pycrl、mrpl28、cdc42和ccnh基因。为了进一步检测短暂性腺分化早期的高温处理对雌激素合成关键基因cyp19a1a的持续性影响，本研究利用本实验室构建的cyp19a1a表达载体，诱导原核表达cyp19a1a蛋白，利用亲和层析技术纯化蛋白，用其免疫8周龄昆明白小鼠获得多克隆抗体。利用Western blot检测高温处理后cyp19a1a蛋白表达情况，结果发现高温处理后cyp19a1a蛋白在TF和IM中均表达显著下调。
　　总之，本研究结果显示了高温处理导致尼罗罗非鱼雌鱼卵母细胞排列疏松，对于雄鱼没有显著影响；显著下调了雌激素合成基因，显著上调了雄激素合成基因，并持续影响了卵巢分化和发育重要基因cyp19a1a相关基因、温度响应基因和一些核受体基因的表达水平。初步证明了性激素合成代谢可能在一定程度上介导了高温处理尼罗罗非鱼性逆转的过程以及性腺分化早期的高温处理对一些基因具有持续性调控作用。本研究的结果为进一步探索高温处理尼罗罗非鱼性逆转过程中的分子机制提供了重要基础。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1 脊椎动物的性别决定机制

1.2环境因素对鱼类性别决定与分化的影响

1.3鱼类性别逆转研究现状

1.4尼罗罗非鱼简述

1.5尼罗罗非鱼的性别决定机制

1.6尼罗罗非鱼性别分化基因

1.7鱼类性腺转录组学研究进展

1.8本研究的目的与意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.2试验方法

3结果与分析

3.1高温处理尼罗罗非鱼雄性率统计

3.2高温处理后XX雌鱼性腺转化为精巢

3.3高温处理尼罗罗非鱼性腺转录组数据统计结果

3.4高温处理尼罗罗非鱼性腺转录组差异表达基因

3.5高温处理尼罗罗非鱼差异表达基因注释

3.6高温处理后类固醇合成酶基因及核受体基因的表达模式

3.7性别分化相关基因验证

3.8 Cyp19a1a多克隆抗体制备

3.9高温处理对尼罗罗非鱼性腺cyp19a1a蛋白表达的影响

4讨论

4.1高温处理尼罗罗非鱼性腺产生差异转录组图谱

4.2高温处理后部分遗传雌鱼性逆转为雄鱼

4.3不同家系的伪雄鱼后代对高温处理敏感性不同

4.4高温处理对尼罗罗非鱼性腺基因的持续性影响

结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文