拟南芥内质网蛋白SES1调控盐胁迫抗性的分子机理研究

摘要

土壤盐渍化严重影响植物的生长及发育，成为限制当今作物产量的主要环境因素之一。土壤中的高盐能打破植物体内的离子平衡，对植物造成渗透胁迫、离子毒害及氧化损伤。全球大约 20%的耕地及将近一半的灌溉土地受到盐胁迫的危害。因此，如何高效的利用盐渍化土壤、培育耐盐新作物，成为全球广泛关注的问题。 为了在盐渍化土壤中生存，植物进化出多种生理生化机制保护自身，减轻盐胁迫对其造成的伤害。例如：重建体内离子平衡、合成渗透保护物质、激活抗氧化酶活性及调控盐胁迫下基因的表达等。同时，近几年研究表明，内质网在应对盐胁迫信号转导及整合方面也发挥重要作用。盐胁迫严重影响内质网中蛋白质的加工折叠过程，导致内质网中未折叠蛋白积累，引发植物内质网胁迫。然而，盐胁迫与内质网胁迫之间的调控关系仍然不清楚。 通过正向遗传学，我们分离鉴定了拟南芥中调控盐胁迫抗性的重要功能基因 SES1 （SENSITIVE toSALT 1），并阐明了其通过缓解盐害造成的内质网胁迫，从而增强植物的盐胁迫抗性。主要实验结果如下： （1）从EMS诱变的拟南芥突变体库中筛选并鉴定了一株盐敏感突变体ses1-1。通过图位克隆确定突变基因为SES1。SES1能完全互补ses1-1及T-DNA插入突变体ses1-2的盐敏感表型。 （2）SES1是植物特有的一类含有Saposin B结构域的蛋白质。ses1-1突变的谷氨酸位于该保守结构域内，且该氨基酸在植物界高度保守。拟南芥中共有6 个蛋白含有该结构域。进化关系显示其余5个蛋白与SES1亲缘关系较远。在其它植物中，SES1同源蛋白的功能未知。 （3）过量表达SES1并没有增强转基因拟南芥的盐胁迫抗性。 （4）ses1-1和ses1-2不仅对NaCl超敏感，而且对NaNO3、KCl、KNO3、LiCl及甘露醇的抗性均明显下降，表明SES1不仅调控盐胁迫抗性，也是渗透胁迫抗性所必需的功能基因。 （5）SES1在拟南芥根、茎、叶、花、果荚、种子均有表达，且受盐胁迫诱导上调。SES1定位于内质网中，且其亚细胞分布不受盐胁迫影响。 （6）对照及盐处理条件下ses1体内Na+含量及盐胁迫响应基因的表达水平与野生型相比无明显差异。RNA-seq 结果显示盐胁迫处理后 ses1 体内参与内质网胁迫相关基因的表达量发生明显改变，表明盐胁迫处理后 ses1 受到更严重的内质网胁迫。蛋白质组分析检测到14种参与内质网中蛋白折叠加工的组分在NaCl处理后的ses1-2中明显增多，表明盐胁迫条件下，更多未正确加工折叠的蛋白在ses1-2体内积累。透射电子显微镜观察发现盐处理后ses1内质网明显肿胀，形成许多内质网池并出现撕裂现象。 （7）SES1具有分子伴侣的活性，能参与蛋白质的折叠过程，且分泌路径Marker蛋白secGFP在ses1体内的荧光信号明显强于WT，且荧光信号主要产生于内质网，表明SES1缺失影响蛋白折叠加工，导致分泌蛋白滞留在内质网内，造成内质网胁迫。 （8）SES1受内质网胁迫试剂衣霉素诱导表达，且ses1对衣霉素敏感。SES1启动子中含有内质网胁迫响应元件 ERSEL，EMSA、ChIP 等实验均证明内质网胁迫感知因子bZIP17能通过靶向ERSEL元件激活SES1表达。在bzip17体内过量表达SES1能恢复bzip17的盐敏感表型。

目录

声明

符 号 说 明

1 引言

1.1盐胁迫对植物的影响

1.2植物应答盐胁迫的生理生化机制

1.3内质网及内质网胁迫响应

1.4盐胁迫与内质网胁迫

1.5本课题的目的和意义

1.6研究思路和技术路线

2 材料与方法

2.1材料

2.2方法

3 结果与分析

3.1盐敏感突变体ses1的筛选鉴定

3.2 ses1突变基因的确定

3.3 SES1编码蛋白理化性质分析

3.4 SES1过量表达株系盐胁迫抗性分析

3.5 ses1在离子毒害和渗透胁迫下的表型分析

3.6 SES1表达模式分析

3.7 SES1亚细胞定位分析

3.8 ses1盐敏感与体内Na+含量分析

3.9转录组分析盐胁迫处理前后ses1体内基因表达变化

3.10蛋白组分析盐胁迫处理前后ses1体内蛋白水平的变化

3.11盐胁迫处理前后ses1内质网的形态分析

3.12 SES1对内质网中蛋白质折叠的影响

3.13 SES1参与植物内质网胁迫响应分析

3.14转录因子bZIP17靶向SES1启动子ERSEL元件调控SES1表达分析

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文及成果