多粘类芽孢杆菌SC2发酵条件优化及抑菌物质的分离纯化

摘要

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是一类对植物生长有明显促进作用的植物根际促生菌（Plant-growth-promoting rhizobacteria, PGPR），现已广泛应用于农业生产中。多粘类芽孢杆菌SC2分离自辣椒根际，本文对多粘类芽孢杆菌SC2抗细菌活性物质的发酵条件及其培养基配方进行了优化，并对抗细菌活性物质进行了分离纯化，主要内容如下： 以阿须贝培养基为基础培养基，通过单因子试验确定了最佳碳源、氮源、以及添加金属离子对抗菌物质产量的影响。通过正交设计，响应面分析，确定抑菌率最大时的最优培养基。最后最适的发酵温度。结果表明蔗糖、硫酸铵为最佳碳氮源。除镁离子外，锰离子、锌离子对多粘类芽孢杆菌SC2胞外抗菌物质的产生均具有抑制作用，最终，确定SC2的最佳发酵培养基配方为蔗糖43.60g/L、(NH4)2SO4 6.66g/L、CaCO3 6.26g/L、MgSO4 0.2g/L、KH2PO4 0.2g/L、NaCl 0.2g/L，最佳发酵温度为37℃、培养时间为60h。抗菌物质的最终产量提高了大约4倍。 为了获得发酵液中较纯的抗菌物质并对其进行鉴定，本研究对其进行了分离纯化。研究主要采用的方法包括萃取得到棕色粗提物，进行高效液相色谱（HPLC）分析。 通过分析型HPLC分析，共发现了7个活性峰，保留时间分别为：5.5min、7.5min、9min、12.5min、16min、17.5min、23.5min。对 7 个活性峰收集并进行质谱分析，确定了多粘类芽孢杆菌SC2产生的代谢产物中除多粘菌素P1、多粘菌素P2外还有五个未知的抗菌活性物质。通过制备型HPLC分析，共发现5个活性峰，保留时间为11.1min、25.1min、27.8min、33.8min、34.9min。将各活性峰收集、浓缩后进行二次液相分离，优化各峰洗脱条件，分离出抗菌活性物质。通过质谱分析技术，对活性物质的含量、分子量及结构进行了分析，结果显示：保留时间为11.1min的活性峰浓缩液经二次分离后得到两个纯度较高的活性峰。经过一级质谱分析确定其分子量分别为1190、1176，与多粘菌素P2、多粘菌素P1分子量相一致。经过二级质谱分析确定其结构分别与多粘菌素P2、多粘菌素 P1 结构相同。保留时间为 34.9min 的活性峰浓缩液经二次分离后得到两个活性峰，一级质谱分析确定其分子量分别为1230、1258，结构尚未明确。

目录

声明

符 号 说 明

1引言

1.1多粘类芽孢杆菌的研究概况

1.2多粘类芽孢杆菌产抗菌物质的研究进展和应用现状

1.3多粘类芽孢杆菌抗菌物质的作用机制

1.4抗菌物质的分离纯化与结构鉴定

1.5多粘类芽孢杆菌的培养基优化

1.6本研究的立项依据、研究内容、技术路线

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1多粘类芽孢杆菌SC2菌株纯化

3.2不同碳源对抗菌物质产量的影响

3.3不同氮源对抗菌物质产量的影响

3.4不同浓度碳酸钙对抗菌物质产量的影响

3.5不同金属离子对抗菌物质产量的影响

3.6正交实验对发酵培养基优化

3.7抗菌物质产量的响应面分析

3.8温度对抗菌物质产量的影响

3.9培养基优化验证试验

3.10抗菌物质的分离纯化及鉴定

4讨论

5结论

参考文献

致谢

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