小麦U-box基因TaPUB1在小麦耐盐性中的功能分析

摘要

小麦（Triticum aestivumL.）是世界上最重要的粮食作物之一。小麦在生长发育过程中经常受到各种逆境胁迫，特别是盐胁迫。泛素/26S蛋白酶体系统（UPS）是植物中最重要的蛋白质周转系统。该系统主要由泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）、26S蛋白酶体和泛素组成。研究发现UPS参与许多生物学过程，包括信号转导、细胞周期和逆境胁迫响应等。 本实验室前期从小麦中克隆了U-box型E3连接酶基因，命名为TaPUB1。为深入研究该基因在小麦盐胁迫耐性中的功能，本研究中我们转化了小麦，获得了过表达和沉默TaPUB1转基因小麦株系。鉴定了转基因小麦株系的耐盐性，并分析了其生理及分子机制。主要结果如下： （1）通过PCR和qRT-PCR检测分析，对转基因小麦进行筛选鉴定，选择两个过表达株系（TaPUB1-OE3和TaPUB1-OE6）和两个沉默株系（TaPUB1-RNAi1和TaPUB1-RNAi5）进行后续实验。 （2）对不同生育年龄的转基因小麦进行盐胁迫处理，结果发现，与野生型（WT）相比，过表达TaPUB1的小麦株系在盐胁迫下生长抑制程度低，幼根和幼叶生长快。而沉默株系则相反。与WT相比，盐胁迫下过表达株系成苗的光合能力更强，沉默株系光合能力相对较弱。结果表明TaPUB1基因在小麦的耐盐性方面起正调控作用，过表达该基因可以提高小麦的耐盐性。 （3）从离子毒害方面分析了转基因和WT小麦的Na+，K+离子积累以及离子在膜内外的流动情况。结果表明，盐胁迫下，过表达株系的Na+含量较WT低，而K+含量较WT高，进而导致过表达小麦的Na+/K+较WT低，而沉默小麦株系的Na+/K+较WT高。随后检测了细胞膜内外Na+、K+和H+动态流动，发现过表达TaPUB1能促进小麦细胞的Na+外流和减少K+外流，这与TaPUB1能够调节小麦细胞中低Na+高K+的结果相对应。 （4）从生理生化和分子水平分析了转基因小麦的耐盐性机制。结果发现与WT相比，盐胁迫下过表达小麦中ROS含量低于WT，沉默株系中ROS含量高于WT；过表达小麦株系中MDA含量以及电解质外渗率量也低于WT，而沉默株系的MDA含量以及电解质外渗率量与过表达恰恰相反。在盐胁迫下过表达植株的多种抗氧化酶活性高于WT，而沉默株系则相反。这些结果表明在盐胁迫下TaPUB1可能通过提高抗氧化酶的活性来减少ROS的积累，减轻氧化胁迫，从而提高小麦的耐盐性。 （5）检测了转基因植株中某些盐胁迫抗性相关、离子转运相关和ROS清除相关基因的表达。结果发现大部分被检测基因的表达量在过表达株系中上调表达。这可能是过表达该基因提高小麦耐盐性的重要机制之一。 （6）通过酵母双杂筛库，我们得到一个与TaPUB1在核中互作的蛋白TaMP，该基因编码α甘露糖苷酶。将此基因在短柄草中过表达，结果发现转基因短柄草表现出对盐胁迫敏感的表型。表明TaMP基因能够负调控短柄草的耐盐性。 根据以上结果得出，TaPUB1调节小麦盐胁迫耐性可能有以下通路：在生理生化方面上，TaPUB1可能通过诱导离子转运体的活性，调节细胞内Na+、K+和H+在细胞内外的流动，在盐胁迫下维持较低的细胞质Na+/K+比。同时，TaPUB1还可以通过增加抗氧化酶活性，降低盐胁迫下细胞ROS水平，减轻氧化胁迫，进而增强小麦耐盐性。在分子水平上，TaPUB1可能在细胞核中与某些转录相关蛋白互作，进而影响盐胁迫相关基因的表达。TaMP是小麦盐胁迫反应的负调节因子，而TaPUB1在细胞核中与TaMP相互作用。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 植物的盐胁迫响应机制

1.1.1 盐胁迫对植物的影响

1.1.2 植物对盐胁迫的响应

1.1.3 植物对盐胁迫响应的信号转导模式

1.2 泛素/26S蛋白酶体降解途径

1.3 泛素连接酶E3的结构类型和特征

1.4 U-box的结构和功能

1.5 U-box参与植物的盐胁迫响应

1.6 甘露糖苷酶参与盐胁迫响应

1.7 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 植物材料的培养与处理

2.1.3 菌株与转化载体

2.1.4 主要酶与生化试剂

2.1.5 实验引物

2.2 实验方法

2.2.1 Trizol法提取RNA

2.2.2 反转录cDNA的合成

2.2.3 目标基因高保真PCR扩增

2.2.4 琼脂糖凝胶回收

2.2.5 载体连接反应

2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的转化

2.2.7 大肠杆菌质粒DNA提取

2.2.8 表达载体的构建

2.2.9 酵母双杂交实验

2.2.10 原生质体瞬时转化实验

2.2.11 基因枪介导的小麦遗传转化

2.2.12 农杆菌介导的短柄草遗传转化

2.2.13 CTAB法提取基因组DNA

2.2.14 定量表达分析

2.2.15 离子的积累和转运测定

2.2.16 植物生理生化实验方法

2.3 数据统计分析与差异显著性检验

3 结果与分析

3.1 TaPUB1转基因小麦的筛选鉴定

3.2 转基因小麦幼苗期的耐盐性鉴定分析

3.3 转基因小麦在花期的耐盐性和光合参数分析

3.4 盐胁迫下转基因小麦根系K+和Na+积累

3.5 盐胁迫下根系K+、Na+和H+跨膜转运

3.6 盐胁迫对转基因小麦植株活性氧积累及抗氧化能力的影响

3.7 盐胁迫对转基因小麦抗氧化酶活性的影响

3.8 TaPUB1参与盐胁迫响应相关基因的转录调控网络

3.9 TaPUB1与TaMP的相互作用

3.10 TaMP转基因短柄草和拟南芥同源突变体的盐逆境适应性

4 讨论

4.1 TaPUB1正调控小麦耐盐性

4.2 TaPUB1通过调控Na+和K+的积累和转运提高小麦耐盐性

4.3 TaPUB1通过调控ROS清除提高小麦耐盐性

4.4 TaPUB1参与调控盐胁迫相关基因的表达

4.5 TaPUB1与TaMP相互作用共同调节小麦耐盐性

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的论文及成果