小麦F-box蛋白基因TaFBA1在ABA介导的植物干旱耐性中的功能

摘要

植物在生长发育中经常受到干旱胁迫的影响，加强植物耐旱机理的研究对提高植物的抗逆性和农作物的稳产、高产、优质具有重要意义。干旱胁迫下植物体内ABA水平上升，进而提高了植物抗逆性。F-box蛋白作为SCF型E3连接酶的关键亚基，在植物逆境耐性中具有重要功能，但小麦F-box蛋白与ABA调控的逆境耐性之间的关系尚不清楚。 实验室前期克隆了小麦F-box蛋白基因TaFBA1。研究发现，TaFBA1过表达提高了转基因烟草的耐旱性，并且过表达TaFBA1烟草的气孔开度大，意味着TaFBA1在ABA调控的气孔关闭中起负调控作用。本文研究了TaFBA1在ABA介导的植物干旱耐性及气孔运动中的作用，并分析了其分子与生理机制。主要结果如下： （1）用基因组PCR和荧光定量PCR对TaFBA1过表达拟南芥、突变体和TaFBA1回补拟南芥进行筛选。选取过表达株系OE4、OE5、OE6，突变体atfbw2-4、atfbw2-5、atfbw2-6和回补株系R-4、R-5、R-6作为实验材料。 （2）用甘露醇模拟干旱胁迫对各株系进行处理，同时添加ABA合成抑制剂Na6WO4，观察统计种子萌发、子叶转绿和幼根生长。结果显示，正常条件下各株系的这些指标无明显差异；干旱抑制了所有株系的种子萌发、子叶转绿和根系生长，但对过表达株系的抑制小于WT，对突变体的抑制大于WT；突变体中回补TaFBA1后，其干旱耐性明显提高。抑制ABA合成后，干旱处理对所有植株的抑制效应均有减轻，但没有改变各株系之间的差异。这些结果暗示TaFBA1可能没有参与ABA的合成。ABA含量检测的结果也证明了这一点。 （3）对各株系的成苗进行自然干旱处理，检测植株生长和叶片光合能力。结果发现，干旱处理对成苗植株的影响与幼苗基本一致。正常条件下过表达和突变体株系的光合能力，包括气孔导度（Gs）、蒸腾速率（E）、净光合速率（Pn）、细胞间CO2浓度（Ci）都无明显差异。干旱处理后，TaFBA1过表达株系的Gs、E、Pn都高于WT，突变体则反之；Ci无明显差异。结果表明TaFBA1过表达提高了拟南芥的光合能力。 （4）用ABA处理各株系发现，过表达株系的种子萌发率和子叶变绿程度高、幼根伸长快、成苗长势好；突变体植株则反之；突变体回补TaFBA1能够降低突变体对ABA的敏感性。ABA处理条件下，TaFBA1过表达株系的光合能力强于WT，更强于突变体。这些结果说明TaFBA1过表达减轻了ABA处理对拟南芥植株的抑制效应。 （5）特别值得注意的是，干旱和ABA处理条件下，TaFBA1过表达植株有较高的Gs。过表达植株的气孔关闭对ABA反应比较慢，突变体的气孔关闭对ABA反应比较快。说明过表达TaFBA1导致转基因植株的气孔关闭对ABA敏感性降低。 （6）为了进一步探究TaFBA1调控ABA信号通路的分子机制，我们检测了ABA信号相关基因的表达，包括ABA信号响应基因和ABA合成相关基因。结果表明TaFBA1可调控ABA信号响应基因表达，但对ABA合成相关基因影响不大。气孔运动相关基因在过表达植株中均下调。这说明TaFBA1可能通过调控ABA响应和气孔运动相关基因的表达，进而参与气孔开关的调节。 （7）以TaFBA1为诱饵，通过酵母双杂实验获得了两个与TaFBA1互作的蛋白，ABA受体RCAR1和转录因子ABI5。双分子荧光互补实验（BiFC）显示TaFBA1与RCAR1能够相互作用，互作位置可能在细胞膜上。 （8）从生理生化水平分析了各株系的抗氧化能力。结果表明，干旱和ABA条件下，TaFBA1过表达株系中H2O2含量、O2?ˉ产生速率以及MDA含量均低于WT，突变体则反之，回补株系均低于突变体。说明过表达TaFBA1增强了ABA和干旱处理条件下转基因拟南芥的抗氧化能力。这可能是TaFBA1提高拟南芥耐旱性的重要原因。 综上所述，小麦TaFBA1正向调节植物耐旱性，但与ABA生物合成无关。TaFBA1可能通过与RCAR1和ABI5相互作用，调控ABA信号通路相关的基因表达，进而负调节拟南芥对ABA的敏感性。增加抗氧化能力和减少活性氧积累可能是TaFBA1过表达转基因植株耐旱性提高的重要机制。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1干旱胁迫对植物的影响

1.2 ABA信号通路组分

1.2.1 ABA受体

1.2.2 蛋白激酶/磷酸酶

1.2.3 ABA反应的基因表达调控

1.3泛素/26S蛋白酶体途径

1.4泛素连接酶E3的分类及结构特征

1.4.1 HECT型泛素连接酶

1.4.2 RING/U-box型泛素连接酶

1.4.3 APC型泛素连接酶

1.4.4 SCF型泛素连接酶

1.5 F-box蛋白的结构及其功能

1.5.1 F-box蛋白结构

1.5.2 F-box蛋白的功能

1.6 本研究的目的意义

2 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2材料培养与处理

2.1.3菌种与质粒

2.1.4酶及生化试剂

2.1.5引物

2.2分子生物学实验方法

2.2.1转基因拟南芥的鉴定

2.2.2转基因拟南芥基因表达水平的检测

2.2.3载体构建

2.2.4大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2.2.5农杆菌感受态细胞的制备和转化

2.2.6农杆菌转化拟南芥

2.2.7荧光定量PCR

2.2.8酵母双杂实验

2.2.9农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达

2.3植物生理生化实验方法

2.3.1拟南芥种子萌发率统计

2.3.2拟南芥幼苗根长的统计

2.3.3光合参数的测定

2.3.4气孔开度测定

2.3.7丙二醛含量的测定

2.4统计分析

3 结果与分析

3.1转基因拟南芥株系的筛选和鉴定

3.2过表达TaFBA1提高了拟南芥的干旱耐性

3.3 TaFBA1参与调控ABA介导的拟南芥生长和光合作用

3.4 TaFBA1参与调控拟南芥的气孔运动

3.5 TaFBA1对ABA信号相关基因及气孔运动相关基因表达的影响

3.6 TaFBA1与ABA受体RCAR1和转录因子ABI5互作

3.7 TaFBA1参与调控拟南芥的ROS积累和抗氧化能力

4 讨论

4.1 小麦TaFBA1正向调节拟南芥的耐旱性但不参与ABA的合成

4.2 小麦TaFBA1负向调节拟南芥对ABA的敏感性

4.3 TaFBA1可能通过与RCAR1和ABI5互作调控气孔运动相关基因的表达

4.4 减少活性氧积累以及增加抗氧化能力可能是 TaFBA1 提高植物的耐旱性的重要原因

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文及成果