J亚群禽白血病病毒在体内药物选择压下的准种演变及耐药性的产生

摘要

由人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）感染导致的人获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）是目前全世界最为关注的疾病之一，目前对其控制主要通过使用齐多夫定Zidovudine和拉米夫定Lamivudine等逆转录酶抑制剂药物（NRTIs）来实现，NRTIs的使用一方面显著降低了AIDS的发病率，但在药物选择压下HIV耐药性的产生又成为全世界高度关注的热点问题。人的特殊性决定了我们无法在人活体内开展定向的观察来研究HIV体内耐药性的形成机制，目前主要通过病人用药前后对大量样品的序列分析来进行比较性研究或通过某些动物模型和体外细胞模型来研究。禽白血病病毒（Avain leukosis virus，ALV）是第一个证明能诱发肿瘤的病毒，此外，逆转录酶首先在ALV发现并获得1975年诺贝尔医学奖。ALV与HIV同属逆转录病毒并具有极其相似的基因组结构，通常我们将ALV作为研究HIV基因变异和准种演变的极佳模型。前期研究发现ALV在含有NRTIs的体外连续培养传代过程中产生了耐药性，通过对大量毒株实施高通量测序发现了与耐药性产生可能相关的pol基因变异位点，并通过感染性克隆和点突变反向证实相关位点突变后导致ALV产生了耐药性。那么，不同途径感染ALV的SPF鸡体内持续给药后ALV是否容易形成耐药性？在体内决定其耐药性产生的pol基因关键突变位点有哪些？这些突变位点与体外模型所发现的突变位点是否一致？这些问题的一一解答有助于回答ALV是如何通过pol基因突变在SPF鸡体内躲避NRTIs“追杀”并阐述其准种演变规律。 为了避免现有ALV-J感染性克隆的基因单一性，本研究首先从山东某发生血管瘤的海兰褐鸡场中分离鉴定了6株血管瘤相关ALV-J野毒株并完成了其基因组测序，6株病毒全长均在7610-7630nt，与参考毒株相其gp85基因与ALV-J的氨基酸同源性在90%左右，而pol基因的核苷酸同源性在97.1%以上。为了进一步研究ALV-J在体内通过基因突变产生耐药性的机制，本研究以SDAU1701株在6胚龄时鸡胚卵黄囊接种病毒，孵化后持续注射逆转录酶抑制类药物Zidovudine建立了病毒持续性感染和体内药物选择的SPF鸡模型，经过长期的监测证实SDAU1701株产生了对Zidovudine的耐药性，通过高通量测序技术对药物的靶基因pol的两段高度变异区pol-A（273bp）和pol-B（266bp）进行测序分析。结果显示经过长期的Zidovudine选择压力作用，ALV的pol基因出现了两个可能与耐药性相关的基因突变位点T196A（p＜0.05）和V447A（p＜0.05）。然后通过构建pol基因突变的突变株感染性克隆rSDAU1701（T196A/V447A）对其在体外的耐药性进行验证。结果显示在体外突变株SDAU1701（T196A/V447A）明显产生对Zidovudine的耐药性，并且其逆转录酶的活性比原始毒株有明显的提高。 本研究对SPF鸡体ALV-J在抗逆转录病毒药物Zidovudine选择压力作用下产生耐药性的机制进行了研究，发现了病毒在动物体内经过长期药物作用后产生的关键基因突变位点，为解析逆转录病毒在动物体内耐药机制的机制和建立良好的病毒模型奠定了良好的基础。

目录

声明

符号说明

1引言

1.1禽白血病病毒研究进展

1.2 ALV的分类地位、形态、理化特性、化学组成

1.2.1 分类地位

1.2.2 形态大小

1.2.3 理化特性

1.2.4化学组成

1.3 ALV基因组和蛋白

1.3.1 慢性转化型ALV病毒的基因组结构

1.3.2 急性转化型ALV病毒的基因组结构

1.3.3 ALV的蛋白

1.4 ALV的多样性

1.4.1 ALV的亚群

1.4.2 ALV亚群的鉴别方法

1.4.3 内源性ALV和外源性ALV

1.5 ALV的致病性

1.5.1 ALV的一般致病性

1.5.2 禽白血病的致肿瘤作用

1.6禽白血病血管瘤在我国的流行

1.7 禽白血病的防控措施

1.7.1禽白血病的净化

1.7.2禽白血病的预防

1.7.3其他途径控制ALV

1.8 抗逆转录药物在抗HIV治疗中的应用

1.8.1 艾滋病病原学

1.8.2 病毒的复制

1.8.3 HIV的临床治疗药物和方案

1.8.4 AZT对反转录病毒的抑制作用

1.8.5 HIV耐药性的产生

1.9 本研究的目的及意义

2 材料和方法

2.1 试验材料

2.1.1细胞和毒株

2.1.2 试验动物

2.1.3 主要试剂和试剂盒

2.1.4 主要仪器

2.1.5 实验主要使用的药物

2.2 常规试验操作方法

2.2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测ALV-p27抗原

2.2.2 间接免疫荧光（IFA）

2.2.3 组织/细胞DNA的提取

2.2.4 组织/细胞RNA的提取

2.2.5 常规PCR扩增

2.2.6 RT-PCR扩增

2.2.7 扩增产物的回收

2.2.8 回收产物的连接

2.2.9 重组质粒的转化

2.2.10 菌液PCR验证

2.2.11 质粒的提取

2.2.12 重组质粒的酶切鉴定

2.3 试验方法及设计

2.3.1 血管瘤相关ALV-J野毒株的分离鉴定

2.3.2 分离毒株的全基因组测序与分析

2.3.3 病毒增殖及定量

2.3.4 动物试验分组

2.3.5 不同浓度药物的配制方法

2.3.6 不同药物浓度对ALV-J在DF-1细胞复制的抑制作用

2.3.7 不同药物浓度对SPF鸡生产性能的影响

2.3.8 持续对鸡只注射药物

2.3.9 不同组别的鸡只体重指数测定

2.3.10 不同组别鸡ALV-J病毒血症的测定

2.3.11 病毒耐药性的测定

2.3.12 高通量测序分析病毒耐药位点

2.3.13 pol基因突变株rSDAU1701（T196A/V447A）的构建

2.3.14 验证rSDAU1701（T196A/V447A）突变株的在体外的耐药性

3 结果与分析

3.1 血管瘤相关ALV-J的分离鉴定

3.1.1 海兰褐鸡的临床特点及组织病理变化

3.1.2 病毒分离及PCR、IFA检测

3.1.3 病毒全基因组测序分析

3.2 ALV-J在SPF鸡体内AZT药物选择压力下的基因变异和准种演变

3.2.1 病毒定量

3.2.2不同药物浓度对ALV-J在DF-1细胞上复制的抑制作用

3.2.3 不同AZT药物添加浓度对雏鸡生长发育的影响

3.2.4 实验组与对照组体重增长变化

3.2.5 实验组与对照组20周病毒分离结果

3.2.6 ALV-J在AZT药物选择压下耐药性的形成

3.2.7 药物选择压下pol基因高通量测序数据分析

3.2.8 pol基因突变株rSDAU1701（T196A/V447A）的构建及耐药性验证

4 讨论

4.1 ALV作为逆转录病毒体内耐药性研究的试验模型

4.2血管瘤相关的ALV-J野毒株分子变异分析

4.3 与ALV-J耐药性产生相关的pol基因关键突变位点

5 结论

参考文献

致谢

8 攻读学位期间发表论文