B-box转录因子介导UV-B和温度调控苹果果实着色的机理

摘要

果皮颜色是决定苹果市场价值的重要农艺性状。花青苷是决定苹果果实着色的主要色素，其生理合成途径受到许多外界因素的影响，如光照，温度，激素等，尤其是Ultraviolet-B（UV-B）和温度。UV-B通过刺激花青苷合成途径中关键基因的表达来促进花青苷的合成。低温提高了苹果果实的光敏感性，进而促进果实花青苷的积累，保护植物不受氧化和低温伤害。而高温抑制了花青素的合成和积累，最终抑制花青苷的合成。UV-B和温度作为信号分子调控花青苷合成的研究比较多，在其通路中鉴定了很多关键的转录因子，但在果树中UV-B作为信号分子与温度相互作用调控花青苷合成的作用机制尚不清楚。 B-box(BBX)蛋白是一类锌指结构转录因子，其结构包含一个或两个B-box结构域。BBX蛋白在植物生长发育的调控网络中发挥着重要的作用。近些年来，关于BBX蛋白的功能研究越来越深入。尤其是在植物光形态建成，控制开花和响应逆境胁迫等方面。BBX转录因子第Ⅳ亚家族有8个成员（BBX18-BBX25），它们在植物光形态建成中的作用机制已被广泛研究。其中BBX21和BBX22正调控光形态建成，BBX24负调控光形态建成。但是它们在UV-B和温度信号通路中的研究相对较少，其调控花青苷合成的作用机理还不清楚。为了进一步挖掘BBX转录因子的功能和其在UV-B和温度信号通路中的作用，本研究以‘烟富3’为试材，通过表达差异筛选，克隆MdBBX转录因子基因，在基因功能验证及挖掘等方面开展研究，主要结果如下： 1.在果园搭建试验棚对刚摘袋的果实进行UV-B处理，通过对BBX转录因子第Ⅳ亚家族的8个成员做实时荧光表达量分析进行差异筛选。RT-qPCR结果表明MdBBX20的表达量在UV-B条件下显著上调，而MdBBX24出现了下调的趋势。因此本研究将差异表达显著的MdBBX20和MdBBX24作为目的基因进行进一步的功能验证和挖掘。 2.将MdBBX20和MdBBX24分别在苹果王林愈伤和红肉愈伤中过表达，然后在UV-B条件下培养，结果发现与野生型愈伤相比，过表达MdBBX20的苹果王林愈伤会变红，促进花青苷的合成并促进下游花青苷合成结构基因MdCHI、MdDFR和MdANS的表达。而过表达MdBBX24的苹果红肉愈伤会变黄，抑制花青苷的积累并抑制下游花青苷合成结构基因MdDFR、MdANS和MdUFGT的表达。因此MdBBX20能够响应UV-B促进花青苷积累，而MdBBX24在UV-B条件下抑制花青苷的合成。 3.通过酵母双杂交实验，双分子荧光互补实验和Pull down实验分别从体内体外验证了MdBBX20和MdBBX24均能够与MdHY5发生互作形成蛋白复合体。通过对其结构域进行分解分析，MdBBX20/24的第二个B-box结构域以及MdHY5的b-ZIP结构域是两者互作所必需的。LUC荧光报告实验结果表明MdBBX20-MdHY5和MdBBX24-MdHY5蛋白复合体中，MdBBX20能够促进MdHY5与MdMYB1启动子的结合，而MdBBX24的作用正好相反。 4.通过酵母单杂交，EMSA和CHIP实验验证了MdBBX20能够特异性识别并结合下游结构基因MdDFR和MdANS启动子上的G-box，并促进其表达。而通过酵母单杂交，EMSA和LUC报告实验验证了MdBBX24能够与MdANS和MdUFGT启动子上G-box结合，并抑制其表达。同时LUC荧光报告试验还表明在MdBBX24-MdHY5蛋白复合体中，MdBBX24抑制MdHY5与下游结构基因启动子的结合。 5.对MdBBX20启动子上的顺式作用元件进行分析，发现在MdBBX20的启动子上有一个低温响应元件LTR。为了探究MdBBX20在低温信号通路中的作用。将野生型王林愈伤置于低温下处理，结果发现与对照组相比MdBBX20的表达量显著升高。同时将过表达MdBBX20的王林愈伤和野生型王林愈伤放置于不同的UV-B和温度条件下进行培养，结果发现过表达MdBBX20的王林愈伤在UV-B/低温条件下积累的花青苷最多，有趣的是，即使没有UV-B，过表达MdBBX20的王林愈伤只在低温条件下也能积累花青苷。这说明MdBBX20能够响应低温促进花青苷的合成。 6.既然MdBBX20能够响应低温，而且启动子序列中还有低温响应元件。通过酵母单杂交实验和EMSA实验结果发现低温响应通路上的重要转录因子MdbHLH3能够特异性识别和结合MdBBX20启动子的LTR顺式作用元件。MdbHLH3在低温条件下表达量也是显著升高的。这说明MdBBX20能够在MdbHLH3的参与下响应低温促进花青苷的合成。 7.对MdBBX24启动子上的顺式作用元件进行分析，发现在MdBBX24的启动子上存在一个热激响应元件HSE。同样为了验证MdBBX24与高温信号的关系。将刚摘袋的苹果置于不同温度和UV-B条件下的光照培养箱内进行培养，结果发现MdBBX24的表达量在UV-B条件下下调，在高温条件下上调，但苹果果皮的花青苷含量和花青苷合成结构基因的表达量下降。同时通过酵母单杂交和EMSA实验验证了热激转录因子MdHSF3b/4a能够特异性识别和结合MdBBX24启动子上的HSE顺式作用元件。LUC荧光报告试验结果表明MdHSF3b/4a能够促进MdBBX24的表达量。这说明MdBBX24在MdHSF3b/4a的参与下响应高温抑制苹果果皮花青苷的积累和果皮着色。 本研究表明了MdBBX20既能够响应UV-B又能够响应低温，并通过与MdHY5的互作首次阐明了MdBBX20在UV-B和低温信号相互作用下调控花青苷合成的作用机理。同时表明了MdBBX24的表达受UV-B的抑制但能够响应高温来抑制花青苷的合成。

目录

声明

中英文缩略表

1前言

1.1中国苹果产业发展研究进展

1.1.1中国苹果栽培的历史

1.1.2中国苹果产业发展现状

1.1.3中国苹果产业发展趋势

1.2植物花青苷研究进展

1.2.1植物花青苷的结构

1.2.2植物花青苷的作用

1.2.3花青苷的生物合成途径及调控机理

1.2.4影响花青苷合成的因素

1.3 B-box（BBX）转录因子家族研究进展

1.3.1BBX蛋白的结构域特点及其分类

1.3.2 BBX蛋白的功能研究

1.4研究内容及意义

1.4.1 研究内容

1.4.2研究意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株

2.1.3载体

2.1.4 生化试剂和药品

2.1.5引物

2.1.6 培养基配方

2.2 实验方法

2.2.1 DNA的提取

2.2.2总RNA的提取

2.2.3反转录反应

2.2.4荧光定量实验

2.2.5基因的克隆

2.2.6 PCR产物胶回收

2.2.7 连接克隆载体（pLB vector）

2.2.8大肠杆菌感受态（DH5α）的转化

2.2.9 菌落PCR验证与测序

2.2.10 提取质粒

2.2.11载体和质粒双酶切

2.2.12连接载体

2.2.13表达载体构建

2.2.14农杆菌感受态的转化

2.2.15‘王林’及红肉苹果愈伤组织的转化

2.2.16 酵母双杂实验

2.2.17酵母单杂实验

2.2.18双分子荧光互补（BIFC）实验

2.2.19蛋白相关的实验方法

2.2.20 染色质免疫共沉淀实验

2.2.21花青苷绝对含量测定

3结果与分析

3.1BBX转录因子第…家族在紫外条件下的表达差异及筛选

3.1.1UV-B促进富士苹果果实着色和花青苷积累

3.1.2 BBX转录因子的进化树分析及差异基因筛选

3.1.3BBX20和 BBX24及其同源基因的氨基酸序列比对分析

3.2 MdBBX20基因的克隆和功能鉴定及挖掘

3.2.1 MdBBX20响应UV-B促进花青苷的合成

3.2.2 MdBBX20与MdHY5互作形成蛋白复合体促进花青苷合成

3.2.3 MdBBX20能够与下游花青苷合成结构基因及MdMYB1的启动子结合

3.2.4 MdBBX20在MdbHLH3的参与下响应低温促进花青苷的合成

3.3 MdBBX24基因的克隆和功能鉴定及挖掘

3.3.1 UV-B抑制MdBBX24的表达，而高温促进其表达

3.3.2 红肉愈伤中过表达MdBBX24抑制花青苷的合成

3.3.3 MdBBX24与MdHY5互作，并抑制其与MdMYB1启动子的结合

3.3.4 MdBBX24与下游结构基因启动子结合

3.3.5热激转录因子MdHSF3b/4a结合MdBBX24的启动子

4讨论

4.1 MdBBX20/24参与调控UV-B诱导花青苷的合成

4.2 MdBBX20在MdbHLH3的参与下响应低温促进花青苷合成

4.3 MdBBX24在MdHSF3b/4a的参与下响应高温抑制花青苷合成

4.4 MdBBX20/24与MdHY5互作协同调控UV-B和温度信号通路

4.5 MdBBX20/24与花青苷合成结构基因启动子结合

4.6 MdBBX20/24在温度和UV-B介导下调控花青苷合成模式图

5结论

参考文献

7附录

致谢

9攻读学位期间发表的学术论文