禾谷镰刀菌拮抗菌的筛选及拮抗机理的研究

摘要

禾谷镰刀菌是引起小麦赤霉病的主要病原菌，不但会造成小麦减产，还会产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、雪腐镰刀菌烯醇（NIV）和玉米赤霉烯酮（ZEN）等多种真菌毒素，影响小麦的品质和安全，造成经济损失并引发食品安全问题。近年，利用对动植物无毒害的微生物，来抑制禾谷镰刀菌的生物防治方式日益受到人们关注。本研究筛选获得了禾谷镰刀菌的拮抗菌，分离获得了拮抗相关化合物，并对相关的拮抗基因进行了定位。主要结果如下： （1）本研究通过平板对峙实验从小麦籽粒和麦田中分14批次筛选得了禾谷镰刀菌GZ3639的拮抗菌105株，构建了拮抗菌库。对这105株拮抗菌进行16S rDNA鉴定，结果表明，其中包含团泛菌102株，解淀粉芽孢杆菌2株，多粘芽孢杆菌1株。 （2）选取抑菌效果较好的成团泛菌（Pantoea agglomerans）HP3、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BP17、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BL13、多粘芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）FA1、成团泛菌（Pantoea agglomerans）HL2和成团泛菌（Pantoea agglomerans）BL1共计6株拮抗菌，进行小麦原位生防实验，对其发酵液及发酵液粗提物的防效进行初步探究，结果表明，6株拮抗菌均有良好的生防效果。使用拮抗菌发酵粗提物来处理禾谷镰刀菌GZ3639孢子，结果表明，拮抗菌BP17、HP3发酵液粗提物可有效抑制禾谷镰刀菌GZ3639孢子的萌发与菌丝的生长。 （3）对拮抗菌解淀粉芽孢杆菌BP17发酵液中的活性物质进行了分离纯化，利用正丁醇萃取拮抗菌BP17发酵液得到拮抗粗提物，采用硅胶柱的方式基于物质的分子极性进行分离，采用葡聚糖凝胶柱的方式基于物质的分子大小进行分离，采用高效液相制备色谱技术对物质进行纯化，最终从拮抗菌BP17发酵液中分离纯化到1种纯净活性物质，经核磁共振与飞行时间质朴检测鉴定为环-（L-苯丙氨酸-L-脯氨酸）。 （4）应用EZ-Tn5转座子突变获得了拮抗菌成团泛菌HP3的抗性失活突变体102个，抗性减弱突变体113个。使用质粒拯救技术进行转座子插入位点侧翼测序，获得了8个突变体的转座子插入位点。这些插入位点分别是成团泛菌orf04350（52），orf03816，orf03689（369），orf03584（935），orf02567（682），orf00203，orf00165和orf00164基因的编码区。这些基因分别编码含氨基酸腺苷酸化结构域的蛋白质，转录调节因子，等多种功能蛋白。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1小麦赤霉病生防菌

1.1.1芽孢杆菌

1.1.2酵母

1.1.3木霉

1.1.4链霉菌

1.2生防菌防治赤霉病的作用方式

1.2.1寄生作用

1.2.2 抗生作用

1.2.3竞争作用

1.2.4其他作用方式

1.3生防效率评价方法

1.3.1评价培养基上的生防效果

1.3.2植物体原位生防效果评价

1.4生防菌应用策略

1.4.1拮抗菌处理田间残茬减少田间菌源量

1.4.2拮抗菌处理土壤或种子保护小麦种子

1.4.3拮抗菌处理扬花期麦穗减少小麦染病

1.4.4入库前拮抗菌处理小麦减少霉菌毒素积累

1.5抗菌物质的分离纯化方法

1.5.1物质提取方法

1.5.2物质分离方法

1.6转座子应用研究进展

1.6.1鉴定新基因的功能

1.6.2鉴定特定功能的基因

1.6.3检测非编码DNA区域的功能

1.7研究目的与意义

1.8研究内容

2 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验菌株

2.1.2实验小麦品种

2.1.3载体与菌株

2.1.4实验试剂

2.1.5培养基

2.1.6主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1禾谷镰刀菌拮抗菌库的构建

2.2.2拮抗菌鉴定

2.2.3拮抗菌对小麦赤霉病的防治效果验证

2.2.4拮抗菌粗提物对禾谷镰刀菌的抑制作用

2.2.5拮抗菌BP17拮抗物质的分离、纯化与鉴定

2.2.6拮抗相关基因的定位

3 结果与分析

3.1禾谷镰刀菌拮抗菌的筛选

3.2拮抗菌对小麦赤霉病的防治效果验证

3.2.1人工气候箱中拮抗菌对小麦赤霉病的防治效果验证

3.2.2大田中拮抗菌对小麦赤霉病的防治效果验证

3.3拮抗粗提物对赤霉病的抑制作用

3.3.1拮抗粗提物抑制小麦赤霉病效果验证

3.3.2拮抗粗提物对禾谷镰刀菌GZ3639孢子的影响

3.3.3拮抗菌BP17、HP3抑菌谱的测定

3.4拮抗菌BP17活性物质的分离、纯化与鉴定

3.4.1拮抗菌BP17不同处理液抑菌效果验证

3.4.2大孔树脂除杂后各组分拮抗活性验证

3.4.3不同有机溶剂萃取拮抗效果验证

3.4.4正向硅胶柱分离所得组分拮抗活性验证

3.4.5 LH-20葡聚糖凝胶柱分离所得组分拮抗活性

3.4.6高效液相物质纯化结果

3.4.7纯净物质波谱学检测鉴定结果

3.5拮抗基因的定位

3.5.1构建突变子文库

3.5.2突变子DNA的提取与转座子的验证

3.5.3酶切与自连结果验证

3.5.4转座子侧翼序列扩增结果

3.5.5 TA克隆结果

3.5.6基因测序与功能分析

4 讨论

4.1拮抗菌的筛选与生防效果鉴定

4.2拮抗物质的分离纯化与鉴定

4.3拮抗基因的定位与克隆

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况