小鼠精原干细胞新特异性标记物的确定

摘要

目的：近年来男性不育率呈逐年上升趋势，世界卫生组织最新统计结果显示全世界不孕不育症患病率约为10％-15%，其中因为男性不育因素的比例已经占到了一半。人类精液的质量和精子数量下降是造成男性不育的最主要原因。目前，随着科学技术的不断发展，环境污染、遗传、毒物、药物等多种因素的不断作用，地球稀有物种数量不断减少、灭绝，雄性动物生殖能力不断下降，最新研究证实，各种化学污染正让包括人类的雄性动物雌性化，损害雄性生殖器官和生殖力，雄性已演化成为弱势族群，岌岌可危，势必对人类和野生动植物带来难以估量的后果。世界卫生组织预言男性不育症、癌症、心血管疾病将成为21世纪危害人类健康最严重的三大疾病。精子深低温冻存是唯一一种通过生殖扶育手段维持男性生育能力的方法，包括卵泡浆内单精子注射技术和圆形精子注射技术。但其成功率特别低，仅达到25%左右。在无精症患者中，非梗阻性无精症患者占到60%，对于成熟精子的获取显得异常困难。为此如何保护雄性动物包括人类在内的的生殖能力成了摆在当今科学界面前的重要任务、精原干细胞移植技术就是在这样的一个大背景下诞生的具有前沿性的生命技术，该技术是从适龄雄性供体动物采集精原干细胞，注射入适龄受体动物的生精小管中使其产生精子的技术。随着这项技术的不断深入研究,精原干细胞不但可以在同种间进行移植,而且在异种间的移植也获得成功。通过对培养体系的不断完善，筛选、移植方法的不断改进,可以获得更高的移植成功率。精原干细胞移植技术应用的前提是利用特异性的标志物在众多细胞中快速高效的提取目的干细胞，并将其移入到受体组织中。精原干细胞移植为提高优良品种家畜的生产效率、保护野生动物资源、转基因动物的生产及不育症的治疗提供了一种新的方法。目前国际、国内已经研究发现的精原干细胞标志物多达10余个，但均缺乏特异性。本研究就是为了寻找更好的精原干细胞的特异性标记物并观察其在各年龄阶段的动态表达。
　　方法：前期利用iTRAQ蛋白质质谱分析技术观测各年龄阶段精原干细胞蛋白标志物表达的动态变化，运用生物信息学蛋白质组数据库筛选并发现新的标志物（P63、CD71、CD98、ALDH2、E-cadherin、PLZF）。依据在出生后6天小鼠睾丸内性原细胞发育为精原干细胞，以正常雄性C57BL/6小鼠为研究对象，按照年龄段不同随机分组如下：出生1-6天、出生7-14天、出生15-21天、出生22-28天、出生29-35天、出生36-42天、出生43-49天、出生50天以上（共8组），每组6只。首先免疫组织化学染色方法检测以上蛋白在小鼠各年龄段的睾丸中的表达情况，若蛋白在睾丸中的表达具有特异性，用免疫荧光双标法检测新标记物的表达位置，采用已知的SSCs标记物（CD90）做对照，用新发现的标记物在小鼠的各个阶段进行免疫组织荧光双标，来定位新标记物是否在SSCs表达。应用荧光定量PCR技术检测新标记物在小鼠各阶段基因水平的表达量，用蛋白质印迹技术（western blot）检测新标记物在小鼠的各个阶段蛋白水平的表达量。
　　结果：免疫组织化学染色发现，P63蛋白在各年龄段小鼠睾丸中的表达不具有特异性，在生精小管中散在的阳性表达；E-cadherin蛋白在各年龄段小鼠睾丸中基底膜处细胞阳性表达，且在生精小管其他位置也有阳性表达；CD98蛋白在各年龄段小鼠睾丸中的表达不具有特异性，在生精小管中散在的阳性表达；CD71蛋白同样在各年龄段小鼠睾丸中的表达不具有特异性，在生精小管中散在的阳性表达；ALDH2蛋白不在小鼠各年龄段细胞上表达，在小鼠间质细胞中阳性表达。这5个蛋白表达没有特异性。PLZF蛋白在小鼠各年龄段表达且具有细胞特异性。
　　结论：P63蛋白、E-cadherin蛋白、CD98蛋白、CD71蛋白、ALDH2蛋白在小鼠睾丸组织中均有表达，但其不具有精原干细胞表达特异性；PLZF蛋白在小鼠睾丸中表达且具有精原干细胞特异性。

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前言

第一部分 精原干细胞动态标记物的确定

材料与方法

1.实验材料

2.实验方法

结果

1．精原干细胞免疫组织荧光

2. 免疫组织化学染色

3. PLZF免疫组织荧光染色

讨论

第二部分 热应激对睾丸生精细胞的影响

材料与方法

1 实验动物

2 实验方法

结果

1. 热应激小鼠睾丸器官指数

2． HE染色

3．免疫组织化学染色

4. 蛋白印迹检测

讨论

结论

参考文献

综述:高温对男性生殖影响机制的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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