硫酸氨基葡萄糖对颈椎软骨终板软骨细胞退变影响的研究

摘要

目的硫酸氨基葡萄糖对颈椎软骨终板软骨细胞退变影响的研究 方法 1.取材根据 pfirrmann椎间盘退变评级准（Ⅰ-Ⅴ）共 5型的人颈椎间盘软骨终板，使用酶解消化的方法获取颈椎间盘软骨终板当中的软骨细胞，并用甲苯胺蓝染色液对细胞进行检测鉴定软骨细胞，使用相差显微镜来观察软骨细胞的生长情况并用比色法绘制生长曲线。2.从软骨终板中成功分离出软骨细胞在体外培养至 3代，每一型中取一组典型细胞分别标记为 A、B、C、D、E五组，每组实验设为对照组和实验组（实验组为 10μM、100μM、1000μM浓度硫酸氨基葡萄糖）分别干预 72小时，通过 q-PCR检测Ⅱ型胶原、多聚蛋白聚糖（Aggrecan）、MMP-3和 MMP-13 基因的表达。 结果 一、利用酶消化法获得了形态正常，获取大量纯净的软骨细胞，并能在体外稳定增殖。 二、1、GS对多聚蛋白聚糖（Aggrecan）基因表达（1）A组：GS浓度为 10μΜ下调 Aggrecan 基因的表达，GS 浓度为 100μΜ、1000μΜ时上调Aggrecan 基因的表达；B、C组：GS浓度为 10μΜ上调 Aggrecan基因的表达，GS浓度为 100μΜ、1000μΜ时下调 Aggrecan 基因的表达；D组：GS浓度为10μΜ、100μΜ时上调 Aggrecan基因的表达，GS浓度为 10μΜ上调 Aggrecan基因的表达；E组：GS浓度为 10μΜ上调 Aggrecan 基因的表达，GS浓度为10μΜ、100μΜ时下调 Aggrecan 基因的表达。（2）GS为 0、10μΜ时，B、C、D、E与 A相比上调 Aggrecan基因的表达；GS为 100μΜ时，B、C、D、E与 A相比都下调 Aggrecan 基因的表达；GS 为 1000μΜ时，B、D、E与 A相比都上调 Aggrecan基因的表达，C与 A相比下调 Aggrecan 基因的表达。 2、GS 对Ⅱ型胶原的基因表达（1） A、B 组：GS 浓度为 10μΜ、100μΜ时，上调Ⅱ型胶原的基因表达，GS浓度为 1000μΜ时，上调Ⅱ型胶原的基因表达；C、D、E组：GS浓度为 100μΜ、100μΜ、1000μΜ时，下调Ⅱ型胶原的基因表达；（2）GS在 0、10μΜ时，B、C、D与 A相比都上调Ⅱ型胶原的基因的表达，E与相比下调Ⅱ型胶原基因的表达；GS为 100μΜ时，B、C、D、E与 A相比都下调Ⅱ型胶原基因的表达；GS 为 1000μΜ，B、D、E与 A相比都上调Ⅱ型胶原基因的表达，C与 A相比下调Ⅱ型胶原基因的表达。 3、GS对 MMP-3 基因表达（1）A、D组： GS浓度为 10μΜ、100μΜ、1000μΜ时上调 MMP-3 基因表达；B组：GS浓度为 10μΜ、100μΜ时下调MMP-3 基因表达，GS浓度为 1000μΜ时上调 MMP-3 基因表达；C组：GS浓度为 10μΜ、100μΜ时上调 MMP-3 基因表达，GS 浓度为 1000μΜ时下调MMP-3 基因表达；E组：GS 浓度为 10μΜ、1000μΜ时上调 MMP-3 基因表达，GS浓度为 100μΜ下调 MMP-3 基因表达；（2）GS的浓度 10μΜ：B、C、D、E与 A相比上调 MMP-13基因的表达；GS的浓度为 100μΜ：B、E与A相比是上调 MMP-13基因的表达，C、D与 A相比都是下调 MMP-13基因的表达；GS的浓度为 1000μΜ：B、D与 A相比上调 MMP-13基因的表达，C、E与 A相比下调 MMP-13基因的表达。 4、GS对 MMP-13 基因表达（1） A、B、C组： GS 浓度为 10μΜ、100μΜ、1000μΜ时上调 MMP-13基因表达；D组：GS浓度为 10μΜ、100μΜ时下调 MMP-13 基因表达，GS浓度为 1000μΜ时上调 MMP-13基因表达；D组：GS 浓度为 10μΜ、1000μΜ时下调 MMP-13 基因表达，GS 浓度为 100μΜ时上调 MMP-13 基因表达；（2）GS在 0、10μΜ时 B、C、D、E与 A相比下调 MMP-13 基因的表达；GS为 100μΜ时，B、C、D、与 A相比下调 MMP-3基因的表达，E与 A相比下调 MMP-3基因的表达；GS为 1000μΜ时，C、D、E与 A相比下调 MMP-3基因的表达，B与 A相比下调 MMP-3基因的表达。结论: 1、GS对聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因表达：10μΜ浓度 GS上调Ⅰ-Ⅴ型退变颈椎软骨软骨终板软骨细胞中的聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因表达；100、1000μΜ的GS 下调Ⅰ-Ⅴ型退变颈椎软骨软骨终板细胞中聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因表达。 2、GS对Ⅱ型胶原蛋白基因表达：10μΜ、100μΜ浓度 GS上调Ⅰ、Ⅱ型退变颈椎软骨终板软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白基因表达，下调Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型退变颈椎软骨终板软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白基因表达；1000μΜ浓度 GS下调Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型退变颈椎软骨终板软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白基因表达。 3、GS 对 MMP-3 基因表达：10μΜ浓度 GS 上调Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型退变颈椎软骨终板软骨细胞 MMP-3 基因表达，下调Ⅱ型退变颈椎软骨终板软骨细胞 MMP-3 基因表达；100μΜ浓度 GS上调Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型退变颈椎软骨终板软骨 MMP-3 细胞基因表达，下调Ⅱ、Ⅴ型退变颈椎软骨终板软骨细胞 MMP-3基因表达；1000μΜ浓度 GS 上调Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型退变颈椎软骨终板软骨MMP-3细胞基因表达，下调Ⅲ型退变颈椎软骨终板软骨细胞MMP-3基因表达。 4、GS对 MMP-13基因表达：10μΜ浓度 GS上调Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型退变颈椎软骨终板软骨细胞 MMP-13基因表达，下调Ⅳ、Ⅴ型退变颈椎软骨终板软骨细胞 MMP-13基因表达；100μΜ浓度 GS上调Ⅰ、Ⅱ型退变颈椎软骨终板软骨MMP-13细胞基因表达，下调Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型退变颈椎软骨终板软骨细胞 MMP-13基因表达；1000μΜ浓度 GS上调Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、型退变颈椎软骨终板软骨 MMP-13细胞基因表达，下调Ⅲ、Ⅴ型退变颈椎软骨终板软骨细胞 MMP-13基因表达。 说明不同浓度的GS对某些退变类型的颈椎软骨终板有一定的保护作用，但其作用机制比较复杂。

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[1] 彭宝淦,侯树勋,贾连顺,陈德玉.颈椎软骨终板钙化与颈椎间盘退变和椎体骨赘形成的关系[J].中