体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

摘要

目的利用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术转染标记骨髓间充质干细胞(BMSC)；探讨鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)在体外不同的生长因子诱导下向成软骨细胞诱导分化的能力,建立一种理想的软骨细胞诱导分化条件培养基,为软骨修复提供种子细胞,为软骨组织工程提供理论实验依据。方法用全骨髓培养法分离培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC),在体外培养并传代,取第三代BMSC用含BMP-2(骨形态发生蛋白-2)和TGF-β1(转化生长因子-β1)诱导因子的培养基在单层细胞培养模式下观察其向软骨细胞诱导分化的能力,实验分为GFP转染组、未转染组。GFP转染组又分为四组:BMP-2(100mg/ml)诱导组,TGF-β1(10ng/ml)诱导组,TGF-β1,BMP-2(100ng/ml,10ng/ml)联合诱导组,未加任何生长因子组；未转染组同样也分为四组:BMP-2诱导组、TGF-β1诱导组、TGF-β1和BMP-2联合诱导组、未加任何生长因子组。用免疫组化法及流式细胞检测技术对第三代骨髓间充质干细胞进行鉴定,检测其细胞表面抗原CD34、CD44及CD90的表达,用MTT法检测骨髓间充质干细胞的增殖情况并绘制细胞生长曲线,诱导14天后,用倒置显微镜对细胞进行大体观察,用荧光显微镜对转染组进行荧光观测,用阿利新蓝染色检查糖胺聚糖的分泌表达,用免疫组化法检查Ⅱ型胶原表达；用二甲基亚甲蓝(DMB)比色法定量检测糖胺聚糖(GAG)的分泌。结果1、骨髓间充质干细胞体外培养后贴壁、细胞呈梭形、多角形,集落生长,有多个大小不一的突起,胞浆含有较大的颗粒,细胞分裂相多见,核卵圆形,连续传代培养生长良好。细胞生长曲线示细胞生长状态良好。免疫组化法及流式细胞仪对第三代骨髓间充质干细胞(BMSC)鉴定结果为:CD44抗原表达阳性,CD34阳性率:0.20％,CD90阳性率:95.7％,符合实验要求。2、各诱导组中阿利新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化均成阳性表达,且TGF-β1,BMP-2联合诱导组糖胺聚糖(GAG)的分泌量高于同组中其它各组(P<0.05),但转染组与未转染组中TGF-β1,BMP-2联合诱导组糖胺聚糖(GAG)的分泌量没有显著性差异(P>0.05)。3、转染GFP组可在转染后24小时、1周、2周、3周、4周时在荧光显微镜下可表达绿色荧光,且GFP基因转染后对BMSC的增殖分化无显著性影响(P>0.05)。结论1、骨髓间充质干细胞来源充足、容易获取、可以大量传代扩增,加入诱导液后细胞形态发生改变并可向软骨细胞分化,可作为软骨组织工程的种子细胞。2、TGF-β1和BMP-2可诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)向软骨细胞方向分化,且二者联合作用对BMSC向软骨细胞方向诱导分化有明显的促进作用。在DMEM培养基中加入TGF-β1和BMP-2可作为一种理想的软骨细胞诱导条件培养基。3、GFP基因的导入对骨髓间充质干细胞(BMSC)的活性和生物学特性无显著性影响,且绿色荧光可在细胞内长期表达。绿色荧光蛋白(GFP)标记技术转染标记骨髓间充质干细胞(BMSC)可作为一套细胞标记技术追踪研究骨髓间充质干细胞移植后在体内的生物学变化(如迁移定植、分布、增殖和分化等)。

目录

文摘

英文文摘

1. 材料与方法

2.结果

3.讨论

4. 结论

5.参考文献

文献综述

参考文献

英文缩略语

攻读学位期间发表文章情况

个人简历

致谢