丝状真菌尖镰孢Fusarium oxysporum L19嗜热内切葡聚糖酶的研究

摘要

纤维素作为植物细胞壁的主要成份，是自然界中最丰富的可再生性资源。微生物对纤维素的降解是自然界中碳素循环的主要途径，对这个过程的有效利用是解决资源匮乏的重要手段。然而，纤维素的应用研究一直进展缓慢。纤维素酶催化反应的低效率及其在催化过程中的变性失活致使其成本在总成本中的比重居高不下，是生物质转化和有效利用的限制性瓶颈。将纤维素作为低值、环境友好型的资源来利用，仍然存在多方面的限制。 为增强酶的稳定性，大量的嗜热性、耐碱性、耐酸性等极端纤维素酶相继得到研究，但还很少进入实用，这是因为极端酶本身的催化效率存在局限性。从酶催化反应动力学角度分析，影响酶催化速率的主要因素除了酶和底物自身之外，还包括催化环境的影响，其中温度和酸碱度是最重要的环境变量之一。事实上，在普遍采用的“最适温度”下，酶的催化活性与热稳定性之间存在矛盾，依此为据所确定的反应温度致使酶的实际使用寿命缩短，大大的增加了生物工程中酶的成本。由于酶蛋白结构稳定性的影响导致通常所定义的最适pH两侧出现非正态分布，而限制了pH对[H<'+]表征的可靠性，造成很多误解。 本论文针对上述存在的问题，通过对中温纤维分解真菌Fusarium oxysporum L19胞外嗜热及中温内切葡聚糖酶的比较研究，分析了不同温度下两种内切葡聚糖酶的反应特性、合成酶的共同诱导机制以及水解纤维素的协同作用；探讨了嗜热内切葡聚糖酶的耐热机制；揭示了嗜热酶催化效率与稳定性之间的关系；基于对动力学过程的分析，指出了通常采用的表征酶“最适温度”、“最适pH”和热稳定性的方法的局限性，建立了新的表征温度对酶催化动力学和热稳定性影响的新方法，对用pH和[H<'+>]表征酶催化动力学过程曲线的变化进行了比较，有一定创新性的结果。 1.发现中温菌Fusarium oxysporum L19可分泌多种嗜热内切葡聚糖酶和中温内切葡聚糖酶的现象。 F.oxysporum L19是一株典型的中温真菌，具有完整纤维素降解酶系而无木素降解酶。经过初步的分离纯化发现，该菌胞外液中至少含有四种中温内切葡聚糖酶和三种嗜热内切葡聚糖酶(Figs.lA；B)。目前在中温纤维分解菌中还未有嗜热的内切纤维素酶的报道。 该菌内切葡聚糖酶的合成可被结晶纤维素强烈诱导，并受葡萄糖的阻遏；纤维二糖的诱导实验表明，纤维二糖的代谢物质是F.oxysporum L19内切葡聚糖酶表达的诱导物。不同条件下的产酶曲线及复性-SDS-PAGE显示两类内切葡聚糖酶诱导合成的条件相同，在可诱导产酶的培养条件下(碳源、初始pH、培养温度)，该菌胞外嗜热及中温内切葡聚糖酶均具有相同的产酶趋势，表明两种酶受同一个调控机制所控制。 2．从中温菌Fusarium oxysporum L19胞外液中分离到一种新的嗜热内切葡聚糖酶(EGt)的纯组分，该组分在75℃具有最高的催化活性。 EGt的基因序列比对结果表明，EGt与已有的纤维素酶的基因序列显著不同，是一个新的纤维素酶编码序列。通过EGt与同一菌株分离的中温内切葡聚糖酶：EGm比较分析发现，EGt一级蛋白序列中含有较多的Pro、Ala和少量的Cys；二级结构预测及CD分析表明，EGt分子中有更多的a-Helix(36.6％)，而p转角和无规则卷曲则较少，其空间结构为典型的“a／β”型蛋白，而EGm则正相反，分子结构中具有较多β转角和无规则卷曲，a-Helix仅占(11.3％)，为“a+β”型蛋白。这些结构特性说明，EGt蛋白本身的氨基酸组成即具有较好的耐热特征，可形成更具刚性的整体空间结构，使。EGt分子在高温下不易失活变性。热活性及热稳定性分析也表明，EGt在高温下表现出更高的活性和稳定性，不同温度下的EGt和EGm紫外光谱、CD光谱变化进一步证实EGt的变构温度高于EGm。 对EGt与EGm的协同作用分析表明，二者对滤纸类纤维素材料(结晶度45％)具有明显的协同作用。通过对特异氨基酸的修饰发现，两种内切葡聚糖酶的活性中心的特异催化基团不同，Trp的修饰剂N．溴代琥珀酰亚胺(NBS)对EGt有低剂量的灭活作用，表明Trp可能位于其活性中心；而苯乙二醛(PGH)对Ary的修饰结果显示，Ary结构的稳定对保持EGm的活性更为重要；EGt和EGm受不同金属离子的激活和抑制说明，EGt和EGm对催化微环境的要求有所不同，推测二者在对纤维素底物进行酶解时可能具有不同的酶切位点，并因此产生协同作用。 3．提出了以酶催化反应的瞬变速率来表征温度对酶催化动力学影响的新方法。并依此方法将“温度．速率”过程曲线细化为四个阶段，清楚地显示出酶催化速率在不同温度下的动态变化过程。 通常以平均反应速率V<,mean>来表征酶的催化速率，并依此为据把温度对酶催化活力的影响分为升高和降低两个阶段。瞬变速率曲线是利用数值微分的方法对“平均速率-温度”曲线(V<,mean>-T)进行微分求导，即(有化学方程式)获得“瞬变速率．温度曲线”(V<,mean>-T)。瞬变速率表示曲线上曲率的瞬时变化，即以过程曲线上两点连线的斜率作为指标，测定反应的速率及定位整个反应曲线的拐点。拐点的出现表示瞬变速率中出现极大／极小值，为反应过程中发生“相变”的标志。用瞬变速率表征酶催化活力的变化不需要任何酶反应催化假说中预先的假定，能够真实的反映出温度对酶动力学的全面影响。通过这种转换，可以清楚的看出产物累计所带来的表观现象及由于样品浓度不同所产生的影响。 瞬变速率曲线对温度引起的速率的改变是高度敏感的，在同样的温度范围内，以平均速率为指标只能看到这一过程曲线的两个阶段，但若以瞬变速率来表征，则可通过曲线上的拐点和零值点将曲线划分为以下四个阶段(Fig.2)： Ⅰ.速率增加的阶段(Increasing stage) 当温度从起始温度升高到T<,1>温度点，。Vins从最小值增加到最大值。V<,inst>的T<,l>点对应于V<,mean>曲线的1／2最大值点。 Ⅱ．速率降低的阶段(Decreasing stage) 温度从T<,1>升高到Z<,1>，V<,inst>从最大逐渐降低，并趋近于O；而V<,mean>则持续增加到最大。这意味着V<,mean>的实验值在增加而增加的速率在持续降低。 Ⅲ．速率加速降低的阶段(Accelerative decrease stage) 温度从Z<,1>提升到T<,2>，V<,inst>从0降低到最小值，同时V<,mean>值则持续降低至1／2最大值。 Ⅳ. 速率缓慢降低的阶段(Slowing decrease stage) 当温度超过T<,2>时，V<,inst>和V<,mean>都缓慢降低。 通过对数正态方程和Gaussian函数对瞬变速率曲线的拟合可以获得各转点的精确信息。这四个阶段中酶的催化速率分别具有不同的内禀性(intrisic)特征。这种策略不仅可用于温度对酶反应速率影响的分析，还可望应用于其它环境因素对酶反应的作用。 4、提出以反应曲线下面积AUC(Area under curve)为指标，表征温度对酶热稳定性影响 的TIE方程。可准确直观的显示“温度-时间”过程对酶蛋白热稳定性的叠加作用。 由于酶催化速率的改变同时受温度和时间双重的影响，催化速率的变化在这两个因素的影响下其三维图谱呈现曲面形状，因此不能用单一变量精确的表征酶的热失活作用(Fig.3A)。将酶失活过程曲线进行初始时间到终止时间的积分处理而形成的AUC方法能够近似的表征温度和时间的叠加影响(Fig.3B)。通过对影响“AUC-温度”曲线参数的分析，建立了TIE方程来回归这一曲线。从而提出了用酶活力丧失1％、50％和99％的温度参量来精确表征温度对酶热稳定性影响的新方法。 5、提出最适温度的确定需同时考虑催化活性和热稳定性的影响，并通过瞬变速率曲线找到了一个新的温度点(T<,1>)，酶在此温度下可以长期保持最高活力；并进一步提出酶在高温下保持活性主要依赖于结构的稳定。 Ⅰ、通过对EGt和EGm平均速率曲线和瞬变速率曲线的比较分析，发现在最大瞬变速率处曲线出现第一个拐点(T<,1>)，说明曲线的动力学状态已经发生变化，瞬变速率开始降低。考虑温度对酶蛋白的双重影响，提出在T<,1>温度点，V<,inst>最大，而失活速率(V<,inact>)最小。在此温度下酶催化反应能够长时间保持最大速率持续进行，使单位酶的转化量达到最大；Z<,1>温度点，即通常所定义的最适温度，是产物累计最多的温度点。酶在这个温度下进行催化反应虽然能够一次性累计最多的产物，但难以持久进行，生物工程中若选择此点进行催化，实际上不可能得到最大产率。不同酶浓度的瞬变速率曲线显示酶浓度的改变只会影响酶的催化速率，而不会改变T<,1>转点的位置，这一结果说明上述新方法能够监测酶催化的动力学过程。此结果在酶的应用上具有一定的指导意义。 Ⅱ、以比活力表征酶的催化活力，EGm的比活力在很大的温度区间内(283-340K)都比EGt的活力高2-5倍，EGt的分子量为42.7kDa，是EGm(25.5 kDa)的1.67倍，因此每分子酶蛋白的活力仍然低于EGm。但在高温区，EGm的活力仅为EGt活力的1/3。二者在结构上的差别表明，一个酶对极端温度的适应必须首先保证酶蛋白的稳定性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词表

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

研究背景

第一章Fusarium oxysporum L19的分离和鉴定

第二章F.oxysporum L19的胞外纤维素酶系

第三章F.oxysporum L19内切葡聚糖酶嗜热组分EGt和中温组分EGm的分离纯化及性质

第四章EGt的cDNA克隆及序列分析

第五章表征温度对内切纤维素酶催化动力学及热稳定性影响的新方法

第六章pH及[H+]对内切葡聚糖酶活力影响的比较

参考文献

全文总结

致 谢

攻读学位期间发表的学术论文、投稿论文及会议论文