茶多酚EGCG在大肠癌预防中的作用及其相关机制研究

摘要

研究背景： 近年来随着人们生活习惯和饮食结构的改变，大肠癌的发病率呈逐年上升趋 势。虽然对大肠癌治疗的研究已经取得了很大进展，但始终不能改变其发病率高 死亡率高的特点，对患者预后亦无明显改善，因此大肠癌相关预防一直是近年来 研究的热点。对大肠癌发病机制的深入阐明，也使我们有可能在基因水平上进行 检测和干预。有研究表明常食用油炸食品与大肠癌的发病有重要联系，这与高蛋 白食物经油炸后产生具有明显致癌、致突变作用的热裂解产物一杂环胺类物质有 关，其中2-氨基3’甲基咪唑。(4，5-f喹啉(IQ)是含量相对较多的一种。因为 IQ广泛存在于食品中难以完全去除，所以化学预防是防范其潜在健康危害的重 要手段。有研究显示结肠上皮在杂环胺代谢中可能起到关键的拓用。 植物化学保护剂预防肿瘤发生机制相关研究是目前的热点。茶叶是人类最常饮用的健康饮料之一，含有多种抗肿瘤成份，提取物茶多酚中的EGcG被认为抑制肿瘤生长效应最强。目前关于EGCG作用的研究主要集中于调节细胞周期转换和启动凋亡通路两个方面，但确切的抗癌机制尚不十分清楚。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)是物质代谢II相酶中重要的一员，可催化致癌物与葡萄糖醛酸结合，加速其排泄。已有研究表明UGTlA同工酶家族可被多种物质诱导起到潜在的抗癌作用，包括类黄酮类、姜黄素、莱菔子素等。Nrf2基因是锌指蛋白转录因子家族的成员之一，近年的研究发现Nrf2与代谢酶的诱导有关。人类大肠呈现出复杂的UGTlA基因位点表达模式，从人肠道中扩增出的UGTlA8和uGTlA10基因全长转染细胞体外研究发现，二者在致癌物代谢中起重要作用，并具有组织特异性，主要分布于结肠，胃肠道葡萄糖醛酸酶酸化反应是肝脏解毒反应的补充。我们的初步研究结果与Giuliani等的研究相符，即在大肠癌组织中这两种酶活性降低，可能为大肠癌发病机制之一。因此研究诱导UGTlA8和UGTlA1O基因表达的机制对预防大肠癌意义重大。 本研究选择茶多酚EGCG作用于基础UGT酶表达存在明显差异的两种结肠癌细胞系Caco-2和HT-29，研究EGCG诱导UGTlA及其同工酶UGTlA8、UGTlA10表达过程中的Nrf2相关机制；并在动物体内进一步探讨EGCG能否对致癌物IQ引起的大肠粘膜隐窝畸变起到保护作用，分析大肠粘膜UGTlA基因表达的变化及二者之间的关系。 目的： 1．体外分析EGCG对结肠癌细胞毒性作用的浓度依赖效应，探讨不同浓度EGCG可能的作用机制，筛选适宜的EGCG作用浓度进一步分析其诱导UGTlA酶表达的作用，初步探讨Nrf2基因在EGCG诱导UGTlA酶表达过程中的作用。 2．体外封闭结肠癌细胞中Nrf2基因的表达，观察EGCG诱导UGTlA酶表达作用的变化，反向验证Nrf2基因在这一过程中的重要作用。 3．动物体内实验观察EGCG对IQ所致小鼠大肠畸变隐窝灶(ACF)形成的影响，分析小鼠大肠粘膜Nrf2、UGTlA基因及凋亡相关Bax基因表达的变化，探讨EGCG预防大肠癌的可能机制。 结论： 1．茶多酚EGCG通过多种机制干预体外培养结肠癌细胞的生长。较高浓度时通过Bcl-2/Bax相关途径诱导凋亡发生，低浓度时可诱导代谢酶基因的表达。2．茶多酚EGCG可上调Nrf2基因表达，并诱导Ⅱ相代谢酶UGTlA及其肠道专有同工酶UGTlA8、UGTlA10的表达。 3．Nrf2基因在EGCG诱导UGTlA及其同工酶UGTlA8、UGTlA10的表达过程中起重要作用，封闭Nrf2基因可阻断EGCG对UGTlA酶的诱导作用。 4．pSilencer3.1-H1 neo质粒介导的脂质体转染RNA干扰体系能够有效抑制结肠癌细胞Caco-2及HT-29中靶基因的表达。 5．针对Nrf2 mRNA序列204-222 bp位置设计并构建的RNA干扰重组载体pSilence-Nrf2-B 能够有效抑制靶基因的表达，抑制率达80％以上。 6．Caco-2-siNrf2和HT-29-siNrf2细胞为成功构建的低表达Nrf2基因的结肠癌细胞系，可用于Nrf2及相关基因功能分析的研究。 7．茶多酚EGCG能够抑制IQ诱导的小鼠大肠畸变隐窝灶的形成，进而预防大肠癌的发生，这种作用可能主要是通过诱导Nrf2及UGTlA基因的表达，从而增加肠粘膜对致癌物IQ的代谢，减少IQ所致ACF的数量来实现。 意义： 1．本研究体外实验中，验证了高浓度EGCG通过诱导凋亡抑制结肠癌细胞生长的作用机制，并率先提出了低浓度EGCG可通过上调Nrf2基因诱导Ⅱ相代谢酶UGTlA、lA8 1A10的表达来千预结肠癌细胞生长的新机制。 2．本研究利用RNA干扰技术封闭Nrf2基因的表达，建立低表达Nrf2基因的结肠细胞系，正、反向两方面证实Nrf2基因在EGCG诱导UGTlA、1A8及IA10基因表达中的重要作用，为研究Nrf2基因参与代谢酶诱导的机制提供了实验依据。 3．本研究证实RNA干扰技术可以应用于大肠癌化学预防的研究。 4．应用致癌物IQ诱发小鼠大肠粘膜隐窝畸变，构建用于评价大肠癌化学保护剂的动物模型，为大肠癌预防的体内研究奠定了实验基础。 5．本研究从体内、体外两个水平探讨了EGCG诱导代谢酶UGTlA表达在大肠癌预防中的作用，为深入进行植物化学保护剂预防大肠癌的研究提供依据。

目录

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符号说明

前 言

第一部分茶多酚EGCG抑制结肠癌细胞生长及其相关机制的体外研究

第二部分RNA干扰技术封闭Nrf2基因对茶多酚EGCG诱导结肠癌细胞UGT1A及其同工酶表达的影响

第三部分茶多酚EGCG预防杂环胺IQ所致小鼠大肠隐窝畸变及其Nrf2/UGT1A相关机制的体内研究

结 论

致 谢

攻读学位期间发表论文及参编著作目录