CD28拮抗性类肽、CD137结合肽的筛选及生物活性测定

摘要

第一部分 CD28拮抗性类肽的筛选及其生物活性测定 目的： CD28-B7是T细胞活化最关键的，研究最清楚的协同刺激通路。阻断CD28-B7通路是治疗自身免疫病及防治移植排斥的重要策略之一。 目前阻断协同刺激通路的方法主要是用特异性单克隆抗体封闭，如用抗B7的单抗(抗-CD80/86)阻断CD28-B7通路，由于现有的单抗主要是鼠源性的，用于人体后可产生免疫反应，引起过敏反应和疗效的降低，而人单抗制备困难，基因工程产品技术要求和造价高，限制了其在临床的应用。因此，迫切需要研发 出更为廉价、有效的阻断剂。 类肽是近年来发展起来的一种新型小分子受体或酶的阻断剂，可与受体的配 体结合位点结合，阻断受体与天然配体的结合，起到受体抑制物的作用。类肽可根据受体或酶结合位点的三维空间结构设计并通过组合化学的方法合成。其优点 是有高度的受体亲和力和选择性，在体内代谢稳定，制备简单，成本低。 本研究的目的是针对CD28与其配体结合的特异活性位点，用组合化学的方CD28拮抗性类肽；利用噬菌体展示系统展示具有天然结构的CD28同源 二聚体，以此建立一个简单、有效、高通量的体外筛选体系；以噬菌体展示CD28为靶标，筛选与CD28高亲和力结合的类肽药物；在体内外进一步检测CD28拮 抗性类肽药物的生物活性，为CD28拮抗性类肽药物开发奠定基础。 方法： 1．CD28拮抗性类肽设计、合成 根据CD28的三维空间结构及与B7结合关键基序，设计、合成CD28拮抗性类肽药物，以SYBYL7.0软件分析类肽药物与CD28结合空间结构。此项工作主要由本课题合作单位山东大学药学院完成。 2．CD28拮抗性类肽筛选平台的建立—以噬菌体展示具有天然生物活性的CD28靶标 RT-PCR从Jurkat细胞扩增CD28胞外区，将其克隆入噬菌粒载体pComb3HSS，构建的重组载体pComb3HSS—CD28电转入受体菌XLl-Blue，并加辅助噬菌体VCSMl3，使CD28胞外区同二聚体展示在噬菌体表面。以ELISA、流式细胞仪检测噬菌体展示CD28的抗原性和与B7-1的结合力。MTT法检测噬菌体展示CD28对T细胞增殖的抑制活性。 3.以噬菌体展示的CD28为靶标，对CD28拮抗性类肽进行筛选 (1).CD28拮抗性类肽体外非细胞筛选体系的建立 以噬菌体展示CD28为靶标，建立CD28拮抗性类肽体外非细胞筛选体系，即竞争ELISA实验：先将类肽药物与CD28噬菌体一起孵育后，然后将二者的混合物加入包被有抗CD28Ab(或B7)的酶标板上，如果类肽药物能与CD28噬菌体结合，则可抑制CD28噬菌体与酶标板上抗CD28Ab(或B7)的结合，OD值的高低反应类肽药物与CD28的结合的能力，二者呈反比关系。 (2).CD28拮抗性类肽药物与CD28噬菌体结合的特异性检测 包括药物浓度梯度依赖性实验，检测不同浓度类肽药物与CD28噬菌体结合的能力；和噬菌体浓度梯度依赖性实验，检测相同浓度类肽药物与不同稀释度的CD28噬菌体结合的能力。 4．CD28拮抗性类肽体外生物活性检测 以类肽药物对淋巴细胞增殖反应影响，检测类肽药物对CD28-B7协同刺激通路的阻断效应，包括： (1).<'3>H-TdR法检测类肽药物对抗CD28Ab刺激的人T细胞增殖反应影响 (2).<'3>H-TdR法检测类肽药物对抗CD28Ab刺激的小鼠T细胞增殖反应影响 (3).<'3>H-TdR法检测类肽药物对小鼠混合淋巴细胞反应影响 5．以小鼠GVHD模型检测类肽药物体内生物活性。 以C57BL/6为供体鼠，BALB/c为受体鼠，建立小鼠GVHD动物模型，并以此模型进一步检测CD28拮抗性类肽药物对GVHD的抑制效应。 结果： 1．CD28拮抗性类肽药物设计、合成 根据CD28空间结构及与B7结合关键基序，以SYBYL7.0软件计算机模拟设计与CD28结合类肽药物，并以组合化学方法合成了19种与CD28结合的类肽药物。 2．CD28拮抗性类肽筛选平台的建立一以噬菌体展示具有天然生物活性的CD28靶标 成功构建表达人CD28分子胞外区同二聚体的重组噬菌粒载体pComb3H-CD28，并以噬菌体展示系统展示CD28分子。ELISA和FCM结果显示，噬菌体展示CD28可与包被在酶标板上的抗CD28抗体特异性结合，也可与Jurkat细胞表面CD28竞争结合抗CD28抗体，具有CD28抗原性。噬菌体展示CD28可与包被在酶标板上的B7-1特异性结合，也可与Raji细胞表面CD80结合，具有与配体结合能力。体外生物活性实验显示，噬菌体展示CD28可抑制抗CD28抗体刺激的人外周血淋巴细胞增殖反应。结果表明噬菌体展示CD28具有抗原性及生物活性，可用于CD28拮抗性类肽药物的筛选。 3．以噬菌体展示的CD28为筛选体系，对CD28拮抗性类肽进行筛选 以抗CD28Ab包被酶标板的竞争ELISA实验结果显示：CD28噬菌体可以高亲和力与酶标板上的抗CD28Ab结合，分别将10ug的1-19号类肽药物与CD28噬菌体混合后，则不同程度抑制了CD28噬菌体与酶标板上抗CD28Ab的结合，其中7和9号药物与CD28噬菌体的结合力较好。以9号类肽药物进行的类肽药物与CD28噬菌体结合的特异性检测显示，类肽药物与CD28噬菌体的结合有药物浓度依赖性和噬菌体浓度梯度依赖性。 4．CD28拮抗性类肽体外生物活性检测 (1).人外周血T细胞增殖抑制实验结果显示，加入不同浓度的9号或7号类肽药物与PHA和抗CD28Ab联合应用时，T细胞增殖明显低于PHA+CD28Ab刺激组，说明类肽药物可与淋巴细胞表面CD28结合，从而抑制抗CD28Ab对T细胞的协同刺激效应。 (2).小鼠和人CD28与配体结合的关键序列完全相同，因而，与人CD28结合的类肽也能与小鼠的CD28结合。同时，药物的体内试验首先需要在动物体内进行，为进一步研究类肽药物的生物活性，我们首先在体外以<'3>H-TdR法检测了类肽药物对抗CD28抗体刺激的C57BL/6小鼠淋巴细胞增殖反应影响。结果显示，不同浓度的9号类肽药物与抗CD3Ab和抗CD28Ab联合应用时，C57BL/6小鼠的T细胞增殖明显低于抗CD3Ab和抗CD28Ab刺激组。 (3).GVHD为供体的淋巴细胞对受体的MHC分子的应答。阻断CD28-B7途径是防治GVHD反应的理想靶点。我们在体内实验选择的动物模型为小鼠GVHD，因而，首先在体外检测了类肽药物对供受体鼠混合淋巴细胞反应的影响，为体内实验提供依据。小鼠混合淋巴细胞反应结果显示，一定量的9号类肽药物可在体外阻断CD28共刺激信号，从而减轻BALB/C与C57BL/6的混合淋巴细胞反应。 5．以小鼠GVHD模型检测类肽药物体内生物活性。 以小鼠GVHD为体内实验动物模型，进一步检测CD28拮抗性类肽对GVHD的抑制效应。供体鼠为C57BL/6，受体鼠为BALB/c。结果显示：类肽药物治疗可在早期减轻小鼠异基因骨髓细胞和脾细胞移植后GVHD的临床症状；可在早期延长GVHD小鼠的生存时间，但对长期成存率无明显影响；类肽药物可减轻GVHD小鼠肝脏和结肠病理损伤。 结论及创新性 1．本研究在国内外首次提出以小分子类肽药物阻断协同刺激通路抑制T细胞的活化防治自身免疫病及移植排斥反应，并根据CD28的空间结构设计合成了与CD28结合的类肽药物。 2．在国内外首次提出以噬菌体展示靶标作为类肽药物的筛选平台，并以噬菌体展示技术获得了具有天然活性的CD28。以噬菌体展示CD28为靶标建立了简单、快速、高通量的CD28拮抗性类肽筛选体系。筛选出两个结合力较好的类肽。 3．在体内外检测了类肽药物的生物学活性，为以新的小分子类肽药物阻断CD28协同刺激途径，从而防治移植排斥反应和自身免疫病奠定了基础。

目录

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符号说明

第一部分CD28拮抗性类肽的筛选及其生物活性测定

第二部分CD137结合肽的筛选及生物活性测定

第三部分CD137噬菌体展示及其生物活性检测

致谢

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