乙型肝炎病毒大蛋白与HBV DNA的相关性及其致病机制的初步研究

摘要

乙型肝炎病毒大蛋白(large surface proteins of hepatitis B virus，LHBs)是唯一一种具有双重拓扑结构、致肝细胞毒性、反式激活增强病毒复制作用的乙型肝炎病毒包膜蛋白，广受国内外学者关注。由于LHBs具有细胞内强滞留性，在体外难以表达，表达过程中又极易降解，因此将LHBs作为一个整体来进行功能研究相对较少。近年来，通过蛋白修饰等技术，已经可以在体外完整表达并纯化出LHBs，从而使LHBs相关功能研究成为可能。 目前临床上通常以HBeAg来判断乙肝病毒复制及传染性强弱，但当乙肝病毒发生前C与C区变异后，会出现HBeAg阴性而病毒仍保持复制状态的情况，造成临床难以根据HBeAg确定治疗时机。在抗病毒治疗过程中，血清HBV DNA拷贝数的下降是评估其疗效的主要指标，但由于核苷类抗病毒药物只能抑制HBVDNA复制，并不能抑制已经形成的病毒以其DNA为模板的转录和病毒蛋白的表达，故认为在监测病毒复制、观察治疗效果上仅仅采用HBeAg和HBV DNA指标是不够的，有必要增加具有反式激活病毒复制功能和直接对肝细胞产生毒性蛋白的蛋白因子检测，对于这个指标，LHBs是适合的。 HBV能够感染肝细胞的关键是HBV和肝细胞表面受体结合。研究发现LHBspre-S区在空间上具有独特的双重拓扑结构，在包膜内侧可以和HBV核衣壳结合，外侧可与易感细胞受体结合，而究竟HBV与何种肝细胞表面受体结合以及结合后HBV是如何进入肝细胞的，有待进一步研究。另外两种包膜蛋白的功能研究发现，pre-S1蛋白参与HBsAg的运输与分泌，pre-S2则介导HBV粘附人肝细胞，此二者被作为HBV一个新的具有传染性和复制的标志物，可能参与了HBV肝细胞内的装配及分泌。基于噬菌体表面展示的高通量筛选是目前寻找靶蛋白结合肽的优选策略，已被广泛应用到配体-受体关系的研究之中。我们拟采用噬菌体展示的方法，以三种HBV包膜蛋白为靶蛋白，寻找可能与之相结合的肝细胞表面受体蛋白。然后利用RNAi技术，敲除肝细胞表面特异性受体蛋白，观察对HBV感染肝细胞的影响，以此来证实该蛋白是HBV入侵肝细胞的关键受体蛋白。为此，我们首先收集200例慢性HBV感染者的血清，检测HBV LMBs、HBeAg与HBV DNA拷贝数的关联性；同时，应用噬菌体展示技术筛选出可能与三种HBV包膜蛋白相结合的肝细胞膜蛋白，进而通过RNA干扰来验证其是否为肝细胞表面与HBV包膜蛋白确实相结合的蛋白。主要研究内容和研究结果如下： 一、乙肝病毒大蛋白与HBeAg、HBV DNA的相关性研究目的：检测LHBs、HBeAg与HBV DNA拷贝数的关联性，以期寻找对病毒的复制、疗效判断更为敏感的指标。方法：收集200例慢性HBV感染者血清，应用荧光实时定量PCR法检测HBV DNA含量，ELISA法检测LHBs和HBeAg含量。采用卡方检验和方差分析对血清LHBs水平与HBV DNA对数值和HBeAg含量之间相关性进行分析。结果：200例慢性HBV感染者中，HBV DNA阳性率为52.5﹪(105/200)，LMBs阳性率为55﹪(110/200)(X<'2>=0.72，P>0.05)；HBeAg阳性率为54.5﹪(109/200)；LHBs含量与HBV DNA拷贝数对数值之间有良好的相关性，相关系数(r=0.935，P<0.01．)，方差分析显示不同HBV DNA拷贝数组之间，LHBs含量差异有统计学意义(F=136.0，P<0.01)。结论：血清LFIBs和HBV DNA协同检测更能代表HBV病毒复制，并有望成为乙肝治疗疗效判定和治疗时机评定指标。 二、噬菌体表面展示技术筛选乙肝病毒大蛋白结合蛋白目的：筛选LHBs在正常肝细胞表面的结合蛋白。方法：以纯化的LHBs为固相筛选蛋白，用正常人肝细胞的噬菌体T7 cDNA文库进行5轮生物筛选，经噬斑PCR，挑选片段长度不一的克隆，应用酶联免疫吸附试验(EMSA)验证所筛选出结合蛋白，然后对其DNA序列进行测序，将所得DNA序列相对应的氨基酸序列在GenBank中搜索，确定可能与IMBs相结合的蛋白。结果：经ELISA验证获得35个阳性克隆，经同源搜索，初步确定22个可能与LHBs相结合的肝细胞表面蛋白，其中包括人类去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)、人类辅助蛋白5受体等22个已知蛋白，同时还发现9个未知功能蛋白。结论：发现了31个可能与IMBs结合的肝细胞表面蛋白，为进一步研究与IHBs特异性结合的蛋白提供基础。 三、噬菌体表面展示技术筛选pre-S1、pre-S2蛋白结合蛋白目的：寻找乙型肝炎病毒pre-S1、pre-S2蛋白结合蛋白。方法：分别以纯化的HBV pre-S1、pre-S2蛋白为固相筛选蛋白，用正常人肝细胞的噬菌体T7 cDNA文库进行5轮生物筛选，经噬斑PCR，挑选片段长度不一的克隆，应用ELISA验证所筛选出结合蛋白，然后对其DNA序列进行测序，将所得DNA序列相对应的氨基酸序列在GenBank中搜索，确定可能与HBV pre-S1、pre-S2蛋白相结合的蛋白。结果：ELISA分别测定筛选的pre-S1与pre-S2蛋白噬斑裂解液与噬菌体抗体结合的活性，经同源性搜索，初步确定pre-S1结合蛋白25个，pre-S2结合蛋白15个。可能与HBV pre-S1相结合的蛋白包括人体载脂蛋白H，PI-3激酶相关激酶SMG-1同类蛋白等22个已知蛋白，同时还发现3个未知功能蛋白；与HBV pre-S2相结合的蛋白包括细胞色素P450 Ⅰ类A型亚基克隆2个、PI-3激酶相关激酶SMG-1同类蛋白3个、细胞生长抑制蛋白42有2个、膜联蛋白A11转录变异体有1个、转录激活因子5有3个、α酸性糖蛋白有2个、未知功能蛋白2个。结论：发现了25个可能与HBV pre-S1蛋白相结合的肝细胞表面蛋白，15个可能与HBV pre-S2蛋白相结合的肝细胞蛋白，为进一步研究HBV入侵肝细胞途径提供新思路。 四、去唾液酸糖蛋白受体shRNA表达载体的构建及初步功能鉴定目的：证实ASGPR为HBV入侵肝细胞的关键受体。方法：利用RNA干扰技术，设计合成靶向ASGPR的shRNA寡核苷酸序列，将其克隆至带有U6启动子的Pgenesil-1真核表达载体中，构建重组质粒，酶切鉴定、测序分析。将此重组质粒转染入HepC2细胞，敲除肝细胞膜上的ASGPR，观察缺失ASGPR对HBV感染肝细胞的影响。结果：已经成功构建靶向ASGPR的shRNA真核表达载体。结论：为明确ASGPR是否为肝细胞表面与LHBs相结合的关键蛋白奠定基础。

目录

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符号说明

前言

第一部分 乙肝病毒大蛋白与HBeAg、HBV-DNA相关性研究

1. 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 噬菌体表面展示技术筛选乙肝病毒大蛋白结合蛋白

1 材料和方法:

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 噬菌体表面展示技术筛选前S1、前S2蛋白结合蛋白

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第四部分 去唾液酸糖蛋白受体shRNA表达载体的构建及初步功能鉴定

1 材料

2 方法

3 已完成的工作

4 讨论

5 小结

参考文献

总结

致谢

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