IL-8对不同转移潜能肝癌细胞增殖和侵袭的影响以及肝癌和乳腺癌中IL-8与EGFR信号通路的关系

摘要

一、研究背景及目的: IL-8属于趋化因子超家族中的一个成员，是～种内源性和多源性细胞因子，因其能激活和趋化中性粒细胞而被发现，在炎症反应中起重要作用。1 990年Modi用原位杂交将IL-8基因定位于人染色体4q12-21，全长5191 bp，由4个外显子和3个内含子组成。根据氨基酸序列分析，IL-8分子量(SDS．PAGE)为8Kda，其成熟形式有5种，分别由79个、77个、72个、70个和69个氨基酸残基组成。应用重组技术，在大肠杆菌内表达IL-8基因而得到的主要形式的IL-8是由72个氨基酸残基组成。关于IL-8基因表达的调节，目前的文献主要集中于其在转录水平的调控。在IL-8启动子上有多个位点可结合几种不同的转录因子，其中有两个区域对IL-8的转录调节非常重要，它们分别是远端结合AP．1的位点和近端结合NF-K B及NF-IL-6的位点。这些结合转录因子的位点在结构上紧密相关，功能上相互作用，是调节IL-8启动子功能的主要顺式作用元件。在许多类型细胞中都已证实IL-8基因的表达需要这些元件之间高度的协同以达到有效的转录。 IL-8是一种糖蛋白，与受体结合后发生作用。IL-8受体(IL-8receptor，IL-8R)是一个由59 Kda和67 Kda亚单位组成的二聚体糖蛋白，属于7跨膜区G蛋白耦联受体(GPCR)家族，CD编号为CDw128，存在于多种类型的细胞膜上，甚至包括一些不表达IL-8的细胞。IL-8与受体结合引起的反应主要是通过细胞膜上G蛋白耦联的磷脂酰肌醇途径产生的。IL-8受体与百日咳毒素(PTX)敏感的GTP结合蛋白耦合，激活磷脂酶Cβ(PLC<,β>)，将磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP<,2>)分解为三磷酸肌醇(IP<,3>)和二酰甘油(DG)，同时产生两个胞内第二信使，分别激动两个信号传递途径即IP<,3>/Ca<'2+>和DG/PKC通路：IP<,3>通过作用于内质网膜上特异的受体使其内部Ca<'2+>释放，引起胞内Ca<'2+>水平的增加，从而启动胞内Ca<'2+>信号系统，即通过依赖Ca<'2+>、钙结合蛋白的酶类活性变化来调节生理过程；DG则通过激活PKC，以磷酸化的形式对许多蛋白质和酶类进行修饰，从而调节和控制另外一系列的生理过程。在这两个信号传递途径中，参与细胞的DNA和蛋白质合成、细胞的生长分化以及转录调节的主要是DG/PKC通路。目前已知至少有两种不同类型的IL-8R，Ⅰ型受体(CXCRl)特异性地与IL-8结合，Ⅱ型受体(CXCR2)除了与IL-8结合外，还可以和生长相关癌基因(GR0)、单核细胞炎性蛋白-2(MIP-2)和中性粒细胞活化肽-2(NAP-2)等结合。编码两种类型IL-8R的cDNAs已从中性粒细胞中克隆并被分离，这两种类型的受体由位于人染色体2q 34-2q3 5的单拷贝基因编码，两者之间cDNAs编码的氨基酸序列约有77﹪是相同的。肿瘤发展与血管生成密不可分，自从Koch等人发现IL-8与血管生成有关以来，人们开始注意到IL-8与肿瘤的关系。如在胰腺癌、恶性间皮瘤、结肠癌、黑色素瘤中发现它可以作为自分泌生长因子而促进肿瘤的发展，在前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌等肿瘤中则发现它可以促进肿瘤转移，可能是通过促进胶原酶的活性、影响细胞的粘附移动及血管生成所致。但也有少数研究发现它具有抗肿瘤作用：Lee等人发现JL-8转染的卵巢癌细胞体外试验对细胞的生长并没有影响，但是注入小鼠体内后则抑制了肿瘤的生长，而注入IL-8的中和抗体后肿瘤生长又恢复，认为这种抑制肿瘤生长的作用是由注射部位聚集的大量中性粒细胞及巨噬细胞介导的。而且，泰素抑制卵巢肿瘤的作用与它上调IL-8表达从而诱导中性粒细胞聚集有关。已有研究发现肝癌细胞也可分泌IL-8，但是关于肝癌细胞是否表达IL-8R以及表达哪种受体(CXCR 1 or CXCR2)国内外尚未见报道。本研究拟就上述问题以及IL-8分泌与肝癌转移潜能的关系、IL-8及其中和抗体对肝癌细胞增殖及侵袭能力的影响进行初步探讨。 EGFR是研究最为深入的生长因子受体，约三分之一的上皮性肿瘤高表达EGFR，其中也包括乳腺癌和肝癌，其过度表达往往提示肿瘤患者预后较差。EGFR可通过两个不同的途径活化，一个是配体依赖途径：即配体与EGFR结合后，激活EGFR自身酪氨酸激酶活性，使胞内激酶区的数个酪氨酸位点发生自身磷酸化。EGFR的配体主要有EGF和TGF-α，还有Epiregulin、β-cellulin、HB-EGF、Amphiregulin(AR)及epigen，其自身磷酸化位置多在C末端尾部，主要位置是1173、1148和1068等位的Tvr。另一个途径就是非配体依赖途径，也称为转活(transactivation)：即当受到H<,2>O<,2>、紫外线、渗透应力、乙酰胆碱受体、生长激素等刺激后EGFR发生自身磷酸化。研究发现GPCR配体如凝血酶、溶血磷脂酸、内皮素、I等也可诱导EGFR的转活，提示GPCR信号通路与EGFR信号通路之间的cross-talk，作为GPCR配体之一的IL-8是否也有这种作用自然引起了人们的兴趣。Schraufstatter等人发现IL-8可诱导内皮细胞EGFR的转活，这一过程是由CXCR2介导的并且依赖于组织蛋白酶B的活性。在胃癌及结肠癌的研究中发现I-．8诱导了EGFR配体HB-EGF的脱落及EGFR的酪氨酸磷酸化，这一过程是由ADAM介导的。Venkatakrishnan等人在卵巢癌中的研究发现IL-8诱导了与Grb2有关的一些蛋白的磷酸化，其中就包括EGFR和衔接蛋白Shc的亚型，并且EGFR的转活依赖于细胞内Ca<'2+>浓度的增加。在乳腺癌和肝癌中是否也存在着两种信号通路之间的cross-talk是本研究的重点。 二、研究方法: 本研究分为两部分：1．探讨IL-8是否是肝癌的自分泌生长因子及IL-8分泌与肝癌转移潜能的关系：采用双抗体夹心ELISA方法检测HepG2细胞、MHCC97-L(低转移潜能)及MHCC97-H(高转移潜能)三种肝癌细胞IL-8分泌的差异：免疫细胞化学方法(ICC)检测三株癌细胞膜表面是否表达IL-8受体，以及表达哪种受体(CXCRl OrCXCR2)；MTT和matrigel invasion方法分析rhIL-8及anti-IL-8对癌细胞增殖及侵袭的影响。2．探讨肝癌和乳腺癌中IL-8与EGFR信号通路之间是否存在cross-talk：ELISA方法检测rhEGF和anti-EGFR对肝癌和乳腺癌IL-8分泌的影响；western blot方法分析rhIL-8及anti-IL-8对EGFR酪氨酸磷酸化的影响。三、研究结果1、三株肝癌细胞均有IL-8分泌；其细胞膜表面均有IL-8受体的表达，且均表达两种受体(CXCR1及CXCR2)；虽然高转移潜能的肝癌细胞其IL-8分泌比低转移潜能细胞多，但三组比较均未达到统计学差异。 2、rhIL-8及其中和抗体对三株肝癌细胞的增殖均无明显影响，但可影响三株肝癌细胞的侵袭能力：rhIL-8可提高癌细胞的侵袭活性(P<0.05)，其中和抗体则对癌细胞的侵袭有抑制作用(P<0.05)。 3、rhEGF及anti-EGFR均抑制了乳腺癌细胞IL-8的分泌(P<0.05；P<0.01)，而rhIL-8对乳腺癌细胞EGFR的活化并无明显影响，相反anti-IL-8却诱导了乳腺癌细胞EGFR的活化。 4、rhEGF对肝癌细胞IL-8的分泌有促进作用(P<0.05)，anti-EGFR对肝癌细胞IL-8的分泌有抑制作用(P<0.01)，而rhIL-8及anti-IL-8对肝癌细胞EGFR的活化均无明显影响。 四、结论: 1、虽然肝癌细胞可分泌大量IL-8，也表达IL-8受体，但是IL-8并不是肝癌的自分泌生长因子，IL-8的分泌与肝癌的转移潜能也没有关系：IL-8通过促进癌细胞的侵袭而影响肝癌的发展。 2、肝癌及乳腺癌细胞中均未发现IL-8可诱导EGFR的转活，但是乳腺癌中anti-IL-8却诱导了EGFR的转活，提示乳腺癌中GPCR介导的IL-8信号通路与EGFR信号通路之间并无cross-talk，而是竞争抑制的关系。 3、肝癌及乳腺癌细胞中anti-EGFR均可明显抑制IL-8的释放，为anti-EGFR与anti-IL-8合用治疗肿瘤尤其是肝癌的治疗提供了理论基础。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

符号说明

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

附表及附图

参考文献

综述 IL-8在肿瘤发生发展中的作用以及IL-8与EGFR信号通路的关系

致 谢

攻读学位期间发表的学术论文

外文论文